一株鲈塘源植物乳杆菌的分离鉴定及其对养殖水体影响研究

◆作者：巩华 张洪业 赖迎迢 孙承文刘春花陶家发 焦彩虹

◆单位：1.中国水产科学研究院珠江水产研究所；2.广州海诚生物科技有限公司

大口黑鲈（Largemouth bass，Micropterus salmoides），俗称加州鲈，属广温性鱼类，原产美国，我国自1983年引入，现主要分布在广东、江苏、浙江、江西、四川和福建等省份。因生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美且易捕捞，大口黑鲈已成为我国重要的淡水养殖品种，据统计，2016年产量 37.4万吨，2017年产量达45.7万吨，年增长率31.57%。在广东佛山市，顺德区的勒流、龙江、均安、杏坛、乐从等镇养殖大口黑鲈区域比较集中。近年来，由于养殖规模不断扩大，养殖密度大幅提升，大口黑鲈生长过程中出现的病害情况日趋严重，给养殖户带来重大经济损失。

生产中使用益生菌调节水质减少病害发生，乳酸菌属于异养型微生物，在厌氧或兼性厌氧条件下都能分解和利用多种有机碳、氮物质，是生物法处理污水的重要微生物，在污水处理、湖泊及河道治理、养殖水质净化中的应用日益广泛。近年来从鱼体或使用乳酸菌调控水质提高鱼体免疫力有很多报道，也有使用植物乳杆菌进行污水或养殖废水处理，但在淡水池塘底泥中尚未见报道。本研究在顺德地区多年使用乳酸菌的池塘中分离到27株乳酸菌，利用从引起大口黑鲈“烂身病”的嗜水气单胞菌为指示菌进行拮抗作用试验，筛选获得一株具有显著抑菌活性的乳酸菌XTL3，并对该菌株进行了研究，以期为指导生产服务。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样池塘

广东省佛山市顺德区勒流镇，主养大口黑鲈，套养少量鲫鱼和鳙鱼，选择的池塘多年来使用乳酸菌等相关微生态产品保持水质，多年来养鱼透明度保持在30～40cm左右。多数池塘在增氧机上安装溶氧控制器，根据养殖需要，设定池水溶氧的上、下限，实行全自动增氧，始终保持池水溶氧在5mg/L以上。

1.1.2 样品采集

釆样时间为2018年3-4月，水温20～27℃。使用采泥器在池塘的水深约2.0米处的两个点位分别采集池底底泥的表层物 (约5 cm)，将其混合，取约 50mL（约50g）带水的底泥样品置于经灭菌处理的容积为200 mL的锥形瓶中，密封，放入加冰袋的泡沫箱内，当天返回实验室，用于细菌分离培养。

1.1.3 培养基和试剂

LB培养基和MRS培养基，北京奥博星生物技术有限公司；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒 ，DNA marker-D，TagPCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；乳酸菌生化鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培养与分离

将污泥水样品1mL（约1g），用无菌水50mL制成悬浮液，以300目筛绢网过滤，滤液6000 r/min离心，弃去上清液，再以无菌水制成混悬液。

用微量移液器吸取lmL水样滴于盛有100mL的MRS液体培养基的250mL锥形瓶中，滴一滴溴甲酚紫溶液作指示剂。置于恒温培养箱中28℃培养。培养液变黄后，先将培养液摇匀，再用微量移液器吸取0.1mL培养液滴在MRS固体平板上，用玻璃刮铲涂匀。长出菌落后，根据菌落颜色、大小、边缘光滑程度等形态学特征对细菌进行分类，用接种环挑取少量菌在MRS固体平板上划线，直至出现单菌落。挑取单菌落在MRS固体平板上划线，获得纯培养。

1.2.2 拮抗菌的筛选

以实验室前期保存的大口黑鲈“烂身病”的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila） 为指示菌，采用牛津杯法测定所分离的乳酸菌对嗜水气单胞菌的抑制效果。用接种环刮取少量指示菌，使用灭菌生理盐水稀释后均匀涂布于牛津杯打孔的LB平板上。同样，用接种环刮取活化24h的分离菌株，使用灭菌生理盐水稀释后取150μL置于小孔内，28℃培养24～36 h，观察小孔周围抑菌圈情况。最后，选取具有最佳抑菌效果的乳酸菌XTL3作为候选益生菌。

1.2.3 革兰氏染色与镜检

取新鲜单菌体进行革兰氏染色，光学观察进行形态鉴别，步骤参照《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》。

1.2.4 菌株的生理生化鉴定

参照麦氏比浊法制备0.5麦氏浊度的菌悬液，以细菌微量检定进行生理生化指标的测定，步骤参照《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》。

1.2.5 16Sr DNA序列分析

利用灭菌去离子水将纯化的乳酸菌XTL3制成菌悬液，采用北京天根生物细菌基因组DNA提取试剂盒进行细菌DNA的提取。利用细菌16Sr DNA基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） 对细菌总DNA的相应序列进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后进行测序。将测序结果通过Blast检索程序与NCBI基因库中相关序列进行比对，并通过MEGA6.0软件构建系统发育树。

1.2.6 养殖池塘安全性和效力检验

将获得的菌株进行规模化生产，调节优化得到各项生产参数（另文发表），最终得到1.1×1010CFU的菌液。

2018年10-11月在顺德区勒流镇某养殖池2口分别设置为实验池和对照池，面积为10亩，池形呈东西向的长方形，建有独立的进排水系统，水深为2.0米左右，放养大口黑鲈1800尾左右，体重约 200～300g，套养少量鲫鱼和鳙鱼。配备相应的增氧机、投饲机等生产设施，试验期间每天开2h的增氧机，保持透明度为35cm左右。

其中实验池塘于10月25日、11月3日分别使用分离到的乳酸菌液，剂量为每亩0.5L。

连续1个月跟踪检测使用情况，每天记录生产管理情况，每天上午8点左右使用便携式水质分析仪检测水体溶氧和氨氮的水平的变化，设置差异显著性水平P为0.05，当P＜0.05时认为差异显著，当P＜0.01时认为差异极显著。

2 结果

2.1 菌落形态及菌体状态

利用MRS培养基对养殖池塘底泥样品中的乳酸菌进行培养、分离与纯化，共获得27株乳酸菌。通过对指示菌的拮抗实验筛选出1株具有显著拮抗作用的乳酸菌XTL3，该菌株对的生长均有良好的抑制作用。该菌株形成的群落表面光滑，有光泽，中央隆起，不透明，乳白色或淡黄色，具有酸味。显微镜下呈直或弯杆状，两端呈圆形突起，革兰氏染色阳性，无鞭毛，无芽孢(图 1、图 2）。

图1 MRL培养基分离池塘乳酸菌

图2 菌株XTL3革兰氏染色

2.2 菌株鉴定结果

根据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)和《伯杰氏细菌鉴定手册》(布坎南等，1984)植物乳杆菌和芽孢杆菌属特征，比对测试结果显示，菌株XTL3生理生化特性与植物乳杆菌一致（见表1）。

表1 菌株XTL3生理生化特性

采用通用引物对菌株XTL3的16Sr DNA PCR扩增产物进行序列测定。使用Blast软件对所获得测序结果在NCBI数据库进行序列相似性比对分析，系统发育树如图3所示。结果表明，本研究分离获得的菌株XTL3属于乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)，与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ATCC14917）的相似性为100%。

图3 菌株XTL3基于16S rRNA序列的系统发育进化树

2.3 养殖池塘安全性和效力检验结果

分别在2018年10月25日和11月3日，在顺德区池塘的两口养殖场池塘全池泼洒该乳酸菌液，在使用过程中的一个月内，经历一次暴雨天气，无异常死亡，无病害发生。

对池塘的溶氧和氨氮进行检测，日际变化如图4、图5所示。经检验，两口池塘的溶氧变化差异不显著（P＞0.05），氨氮的变化差异显著（P＜0.05）。从变化曲线上看，实验池塘的两项水质指标总体优于对照塘，而且实验塘的水质变化小，显示池塘环境变化小，更稳定。

3 讨论

乳酸菌属于异养型微生物，在厌氧或兼性厌氧条件下都能分解和利用多种有机碳、氮物质，是生物法处理污水的重要微生物，在污水处理、湖泊及河道治理、养殖水质净化中的应用日益广泛。乳酸菌作为主导菌应用于水质净化的效果良好，在成鱼养殖池中使用乳酸菌，实验池溶氧量比对照池提高 11.2%，NH4+-N和NO2-N含量分别降低了54%、55%，饵料系数降低8.2%，单位面积净产量提高14.4%。范毛毛等（2011）在草鱼饲料中添加0.2%～0.4%的高性能乳酸菌，每10d拌饵投喂1次，使用3个月后，水体中的 NH4+-N、NO2-N、HS等有害物质含量下降，溶氧量和水体透明度显著增加，草鱼的产量有所提高。

在河蟹养殖过程中，会因藻类、水草的生长消耗大量的钙磷镁碳等，造成水体碱度快速下降，但直接使用生石灰，会造成pH急剧升高，易诱发氨中毒，还会对河蟹造成一定的应激反应。目前生产上使用钙镁合剂和乳酸菌一起使用，平衡河蟹池塘水体pH值升高和总碱度下降的问题。

图4 使用植物乳杆菌调节池塘水溶解氧浓度变化比较

图5 使用植物乳杆菌调节池塘水氨氮浓度变化比较

2016年起，在生产实践中发现，泼洒使用植物乳杆菌调节池塘水质，使用初期3-5天内水色不同程度地调节到传统要求的“肥、活、嫩、爽”状态，但之后水色又会渐渐恢复到原来状态。针对这种情况，有观点认为，目前水产中使用的乳酸菌等都是从畜牧业或者食品加工业中移用的微生物，不适应水体环境，因而在泼洒后很快发挥作用，之后渐渐被环境淘汰。

针对这种情况，2018年3-4月，对使用菌液后的池塘采用选择性培养基进行调查，共计筛选到27株乳酸菌。以引起大口黑鲈“烂身病”的嗜水气单胞菌为指示菌进行拮抗作用试验，筛选获得一株具有显著抑菌活性的乳酸菌XTL3。该乳酸菌来自池塘环境中，可见乳酸菌能够在养殖环境中有效存活，并发挥其生理功能，因此在可以有效应用于养殖生产中。

在本实验中，使用乳酸菌，对各项水质指标会有改善，特别是溶氧，在使用后总体会稳步提高，显然一方面能降低水体内包括大多数病原菌在内的兼性厌氧菌的存活，另一方面还能降低养殖动物因为环境因子剧烈变化而产生的应激反应。我们也发现，确实存在使用3-5天后水色有转变的现象，从水质变化上也能显示出这种现象，因为使用3-5天后，水质因子就开始出现变化。许多研究表明，乳酸菌等能通过氧化、氨化、固氮、硝化和反硝化等作用，将养殖过程中产生的残饵、粪便以及其它的有害物质迅速地分解为CO2、硝酸盐、磷酸盐等无毒无害的营养物质来达到净化水质的目的；同时提高水体中的溶解氧，保证养殖水环境的洁净，促进养殖生物的健康生长（李咏梅等，2018），这些作用同时也是抑菌作用。另外，乳酸菌可以连续使用，如本实验中第二次使用后，水质总体稳定时间比较长。

但是乳酸菌在水环境中如何代谢生长，其群落如何演替，对病原菌的抑制是否同时也抑制了环境常在菌，这些需要进一步研究，以指导生产科学规范地使用该类制品。