外周血miR-150-5p、SOCS1 mRNA对类风湿关节炎“病”“证”诊断意义的初步探讨＊

邱明亮，朱卫娜，莫丽莎，徐卫东，高 波

（1. 江西中医药大学 临床医学院 南昌 330006；2. 江西中医药大学附属医院风湿病科 南昌 330006；3. 江西中医药大学附属医院儿科 南昌 330006；4. 南京医科大学附属常州第二人民医院风湿免疫科 常州 213003）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种在成人当中常见的以关节病变为主的系统性、炎症性自身免疫性疾病，全球约有1%的人群受其累[1-2]。现代医学对于本病的研究，虽取得了长足的进步，但仍有部分患者误诊或延后诊断，错过了最佳治疗窗。需不断探讨新的生物标志物，以更明确的诊断本病。我国医学认为，本病是风寒湿邪客于关节，气血痹阻，导致以小关节疼痛、肿胀、晨僵为特点的疾病，属于“尪痹”“痹证”“历节”等范畴。中医药治疗本病，限于证候客观化研究的不足，作为临床治疗核心理念的“辨证论治”，无法充分发挥其指导作用。寻找客观化指标，以指导“病”“证”的诊断，成为了中医药治疗本病研究的重中之重。

作为表观遗传学机制之一，miRNAs 是真核生物内源性基因编码的、长度为18-25 碱基的单链非编码RNA。既往研究表明，miRNA 在固有免疫、适应性免疫及炎性因子的信号转导过程中起着重要的调节作用[3]。Chen Z 等[4]发现，间充质细胞来源的miRNA-150-5p 可通过靶向结合于基质金属蛋白和血管内皮生长因子，减少类风湿成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭，抑制微管的形成。细胞因子信号传导抑制因子（SOCS）是细胞因子信号传导的经典抑制剂，由至少8种成分组成，即SOCS1-7 和CIS。其中SOCS1 在免疫细胞的调节中发挥重要作用[5]。Egan 等[6]研究发现，在mBSA-和IL-1诱导的关节炎小鼠模型中，相对于野生型小鼠，SOCS1-/-小鼠更易产生急性关节炎。De Hooge 等[7]在酵母聚糖诱导的大鼠模型中，证明缺乏STAT1 的炎症性滑膜中，SOCS1 的水平明显下降。提示miRNA-150-5p、SOCS1 mRNA 可能参与了类风湿关节炎的发生发展过程。

Zhou H 等[8]报道，过表达的miR-150-5p 可显著降低狼疮性肾炎的近端肾小管和系膜细胞中SOCS1 的表达，提示miR-150-5p 通过下调SOCS1 来增加促纤维化分子，从而促进肾纤维化。这说明SOCS1与miR-150-5p 关系密切。RA 患者中，SOCS1 与miR-150-5p是否存在靶向结合关系，两者是否可作为RA 诊断的生物标志物，值得深入探讨。

本研究拟基于miR-150-5p及SOCS1 mRNA，初步探讨两者在类风湿关节炎患者中的表达以及对西医疾病和中医证型判断的指导意义，以期为类风湿关节炎“病”“证”的诊断提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为自2018 年5 月至2018 年12 月，江西中医药大学附属医院风湿病科门诊和住院部就诊的57 例RA 患者，我院健康体检中心的19 例健康对照者（health control，HC）。本研究已获我院伦理委员会审议通过。

1.1.1 纳入标准

纳入标准：①符合2010 年ACR/EULAR 类风湿关节炎分类标准[9]；②年龄≥18 岁，且≤80 岁；（③受试者知情同意，并签署了知情同意书。

1.1.2 排除标准

排除标准：①年龄>80 岁或<18 岁者；②晚期严重关节畸形、功能丧失的患者；③妊娠或哺乳期女性患者、精神病患者；④有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病者；⑤精神病患者。

1.2 方法

1.2.1 检测指标及方法

所有受试者均记录年龄、性别，并测定血常规、肝功能、肾功能。同时，所有RA 患者均记录患者发病年龄、病程、用药史及合并疾病，且均采用qPCR 法进行miR-150-5p、SOCS1 mRNA 等测定，采用双荧光素酶方法判断两者是否存在靶向结合关系。

（1）miR-150-5p测定

采集受试者外周血全血10 ml，EDTA-K2抗凝，取淋巴细胞分离液分离，加入2 ml Trizon（CW0580S，CWBIO），涡旋混匀；采用miRNA 提取试剂盒（CW0627S，CWBIO）提取总RNA；采用紫光光度计测定mRNA 浓度、纯度；采用miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒（CW2141S，CWBIO）逆转录cDNA；应用miRNA qPCR Assay Kit（CW2142S，CWBIO），按照Ul‑tra SYBR Mixture（CW0957M，CWBIO）操作流程进行PCR 扩增。以U6 为内参，检测miR-150-5p 的表达水平。MiR-150-5p及U6引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。U6 上游引物：GCTTCGGCAGCA‑CATATACTAAAAT；Hsa-mir-150-5p 上 游 引 物：TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG。每个标本均做3 个复孔，反应结束后作溶解曲线分析。荧光定量PCR 的结果以每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数C（T）表示，C（T）值越大，参与反应的起始模板量就越少，反之则越多。miRNA-150-5p 与U6相对表达量用2-ΔΔCT值表示[10]。

（2）SOCS1 mRNA测定

外周血预处理同前；采用RNA 提取试剂盒（CW0581M，CWBIO）提取总RNA；采用紫光光度计测定RNA 浓度、纯度；采用HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒（CW2569M，CWBIO）逆转录CDNA；按照Ultra‑SYBR Mixture（CW0957M，CWBIO）操作流程进行PCR扩增。以GAPDH 为内参，检测SOCS1 mRNA 的表达水平。SOCS1 及GAPDH 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。GAPDH 上游引物：GAAGGTCG‑GAGTCAACGGAT；SOCS1 上游引物：CGCACTTCCG‑CACATTC。每个标本均做3 个复孔，反应结束后作溶解曲线分析。荧光定量PCR 的结果以每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数C（T）表示，C（T）值越大，参与反应的起始模板量就越少，反之 则 越 多。SOCS1 与GAPDH 相 对 表 达 量 用2-ΔΔCT值表示[10]。

表1 一般资料比较

（3）双荧光素酶报告基因检测

充分裂解293T 细胞后，12000 g 离心2 分钟，取上清；取100µL平衡至室温的Luciferase substrate加入检测管酶标板中，小心吸取20µL 细胞裂解上清至酶标板中，迅速混匀后迅速于酶标仪中检测Firefly lucifer‑ase 报告基因活性；在以上反应液中加入100 µL 新配置的Renilla 底物工作液，迅速混匀后立即于酶标仪中检测Renilla luciferase 报告基因活性。在以Renilla 荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU 值除以Renilla 荧光素酶测定得到的RLU 值。根据得到的比值来比较不同样本间目的报告基因的激活程度。

（4）其他实验室指标测定

均在江西中医药大学附属医院检验科检测。血常规采用血细胞分析仪（SYSMEX，XE-2100）检测，肝功能、肾功能采用全自动生化分析仪（Roche，P 800）检测。

1.2.2 中医辨证分型

所有RA患者均参照国家中医药管理局2010年发布的《22 个专业95 个病种中医诊疗方案》进行中医辨证分型[11]。具体症候包括：①风湿痹阻证：肢体关节疼痛、重着，或有肿胀，痛处游走不定，关节屈伸不利，舌质淡红，苔白腻，脉濡或滑；②寒湿痹阻证：肢体关节冷痛，局部肿胀、屈伸不利，关节拘急，局部畏寒，得寒痛剧，得热痛减，皮色不红，舌胖，舌质淡暗，苔白腻或白滑，脉弦缓或沉紧；③湿热痹阻证：关节肿痛，触之灼热或有热感，口渴不欲饮，烦闷不安，或有发热，舌质红，苔黄腻，脉濡数或滑数；④痰瘀痹阻证：关节肿痛日久不消，晨僵，屈伸不利，关节周围或有皮下结节，舌暗紫，苔白厚或厚腻，脉沉细涩或沉滑；⑤气血两虚证：关节肌肉酸痛无力，活动后加剧，或肢体麻木，筋惕肉瞤，肌肉萎缩，关节变形，少气乏力，自汗，心悸，头晕目眩，面黄少华，舌淡苔薄白，脉细弱；⑥肝肾不足证：关节肌肉疼痛，肿大或僵硬变形，屈伸不利，腰膝酸软无力，关节发凉，畏寒喜暖，舌红，苔白薄，脉沉弱。

1.2.3 统计学处理

数据分析采用统计软件SPSS22.0 计量资料用均数土标准差(±s)表示，计数资料用构成比（%）表示；分类资料组间比较采用x2检验。计量资料两两比较采用独立样本t 检验（方差不齐釆用秩和检验），组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；ROC曲线分析miR-150-5p、SOCS1 mRNA 的诊断意义，其表达水平与中医证型的相关性分析采用无序多分类Logistic分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

57例类风湿关节炎组与19例健康对照组受试者，在性别、血常规、肝肾功能等方面，无统计学差异（P>0.05），具有可比性。健康对照组患者类风湿关节炎患者，其病程为111.33 ± 18.72（月）。RA 入组时用药方面：服用糖皮质激素者6例（10.53%），非甾体类抗炎药28 例（49.12%），甲氨蝶呤33 例（57.89%），来氟米特19例（33.33%），雷公藤多甙10 例（17.54%），中药汤剂6例（10.53%）。 合 并 症 方 面，合 并 高 血 压8 例（14.04%），冠状动脉粥样硬化性心脏病2 例（3.50%），慢性浅表性胃炎2例（3.50%）。（见表1）

2.2 miR-150-5p在RA 患者、健康人外周血的相对表达水平

相对于健康对照组，RA 患者的miR-150-5p 的相对表达水平明显下降，有统计学差异（t = -19.019，P ＜0.05）。进一步将RA 患者组，划分为稳定组和活动组，经One-way ANOVA 检验发现，与健康对照组相比，两组患者的miR-150-5p 的相对表达水平明显下降（F=149.298，P ＜0.05）。活动组比稳定组相比，有下降趋势，但无统计学差异。（见表2）

表2 两组受试者miR-150-5p的相对表达水平

表3 两组受试者SOCS1 mRNA的相对表达水平（±s）

表3 两组受试者SOCS1 mRNA的相对表达水平（±s）

注：RA：类风湿关节炎；HC：健康对照；稳定组定义：RA 患者DAS28-ESR < 3.2；活动组定义：RA 患者DAS28-ESR ≥3.2。#，与健康对照组相比，P<0.05。

SOCS1 mRNA 9.18±0.38 18.12±1.57#14.36±2.13#18.65±1.00#分组HC组（n=19）RA组（n=57）稳定组（n=7）活动组（n=50）

表4 RA的中医证型分布

表5 中医证型与miR-150-5p相对表达量的Logistic回归分析（阳性结果）

图1 双荧光素酶报告基因分析结果

2.3 SOCS1 mRNA在RA及健康对照组的表达水平

相对于健康对照组，RA 患者的SOCS1 mRNA 的相对表达水平明显升高，有统计学差异（t = 5.333，P ＜0.05）。进一步将RA 患者组，划分为稳定组和活动组，经One-way ANOVA 检验发现，与健康对照组相比，两组患者的SOCS1 mRNA 的相对表达水平明显升高（F=6.421，P ＜0.05）。活动组比稳定组相比，有升高趋势，但无统计学差异。（见表3）

2.4 miR-150-5p 降低了SOCS1 mRNA 3′-UTR 的稳定性

SOCS1 mRNA 的3′-UTR 序列的DNA 片段连接到双荧光素酶载体的LUC2 基因的3′端，结合位点为GGGTTGGG。双荧光素酶报告基因测定如下图所示，与阴性对照mimics 组相比，miR-150 mimics 组的荧光素值明显下降，差异具有统计学意义（25.46 ± 1.00 vs 21.84±0.19,P<0.05）。说明miR-150 mimics 降低了连接SOCS1 的3′UTR 序列的荧光蛋白质的mRNA 的水平，证明miR-150-5p与SOCS1靶向结合。（见图1）。

2.5 miR-150-5p、SOCS1 mRNA对RA的诊断预测分析

以miR-150 的相对表达水平为检验变量构建ROC 曲 线，并 计 算 曲 线 下 面 积AUC 为0.974（P ＜0.05）。根据Youden 指数，其最佳界值为3.06（敏感性0.981，特异性0.920）。（见图2A）。

以SOCS1 mRNA 相对表达水平为检验变量构建ROC 曲 线，并 计 算 曲 线 下 面 积AUC 为0.425（P ＞0.05）。故SOCS1 mRNA对RA的诊断无指导意义。（见图2B）。

2.6 miR-150-5p与RA中医证型的相关性分析

频数统计分析发现，本研究中类风湿关节炎患者中风湿痹阻证（38.6%）、寒湿痹阻证（28.1%）、痰瘀痹阻证（14.0%）是常见证型。以miR-150-5p > 3.06，赋值0，miR-150-5p ≤3.06，赋 值1，经 无 序 多 分 类Logistic 回归分析，发现miR-150-5p ≤3.06 人群，其患风湿痹阻证及寒湿痹阻证的风险分别为8.33 倍和250.00倍。（见表4、表5）

3 讨论

图2 miR-150-5p、SOCS1 mRNA相对表达量的ROC曲线

miRNA 主要通过与目标mRNA 的3′端相结合，在翻译水平调控基因的表达。本研究通过双荧光素酶法证明miR-150-5p 与SOCS1 mRNA 有靶向结合关系。再者，本研究测定外周全血miR-150-5p 和SOCS1 mRNA 的相对表达水平。相对于健康人群，miR-150-5p表达水平更低。Niimoto T 等[12]研究报道，相对于骨性关节炎患者，RA 患者外周血产IL-17 T 细胞中，miR-150-5p 显著高表达，与本研究结果似不一致。另有Honda N 等[13]报道，在系统性硬化症患者中，miR-150在外周血中低表达，与本研究结果似乎一致。可以看出，目前的研究结果报道各不一致，符合目前miRNAs 在RA 中的表达多样性的特点[14]。究其原因：①可能与miR-150 的标本来源不同有关，因为同一miRNA 在不同组织或细胞中的表达可不同，甚至同一miRNA 在同一组织或细胞中，因检测方法不同，其结果也有不同；②可能与研究对照不同有关。Niimoto T等进行的研究，其对照人群是骨性关节炎而非健康人群，导致对照标准不统一，因而结果可能无可比性。本研究同时发现，相对于健康人群，RA 患者的SOCS1mRNA 表达水平更高，与既往研究结果一致，进一步验证了SOCS1 mRNA 在RA 中过表达的结论[15-17]。其原因可能为：①RA 患者TNF-a、IL-6、INF-γ 等促炎细胞因子可以激活JAK-STAT 通路，进而可导致SOCS1 表达的上调[18]；②从miR-150-5p 与SOCS1 相互作用的角度，本研究中SOCS1 水平升高的原因，可以用miR-150-5p水平下降来部分解释。

RA 的西医治疗，虽取得了充足的进步，仍有患者因为诊断的延误而导致疾病的不可逆性损害。而早期诊断本病，除了依靠类风湿因子、抗环瓜氨酸抗体等生物标志物，仍需不断发现新的指标，以更早的发现RA 患者，达到早期治疗，延缓病变进展的目的。通过AUC曲线，本研究发现miR-150-5p区分RA的敏感性和特异性分别达到了98.1%、92.0%，说明miR-150-5p 是RA 诊断的有效潜在生物标志物。遗憾的是，本研究发现未能发现SOCS1 mRNA 对RA 诊断的指导意义。

既往类风湿关节炎中医症候研究，大多停留在横断面调查分析层面，缺乏客观化指标的确证[19-21]。作为中医的“证”有即时性与差异性的特点，因为其是某一阶段的情况，所以会处于不断的动态变化之中。而miRNAs 及其表达的动态变化过程与临床表现的症状和体征有内在的联系，具有精确特异的时空表达特点，因此，其可能参与了证候的发生与动态变化[22]。因此，近年来，作为表观遗传学证据之一的microRNAs，在RA 的中医证型相关研究中的重要性，逐步受到重视。本研究发现RA 患者的miRNA-150-5p 的相对表达水平，低于正常人群。miR-150-5p 其界值为3.06，其诊断为风湿痹阻证、寒湿痹阻证的相对危险度分别达到8.33、250.00，说明其是诊断风湿痹阻证、寒湿痹阻证等证型的有效指标。再者，本研究发现，风湿痹阻证、寒湿痹阻证是RA 的主要证型，而不是既往研究所列的湿热痹阻证[19-21]。患者平素体虚，阳气不足，卫外不固，腠理空虚，易为风、寒、湿、热之邪乘虚侵袭，痹阻筋脉、肌肉、骨节，而致营卫行涩，经络不通，发为本病。阳气虚衰，寒气内生，复感风寒湿邪，从阴化寒，而成为风寒湿痹[23]。因此，从病因病机来看，风湿痹阻证、寒湿痹阻证均可能是RA 的主要症候。考虑到本研究的样本量较小，需进一步扩大样本量，以验证本研究结果。

总之，本研究发现，miR-150-5p、SOCS1 mRNA 在RA 患者中的相对表达水平有差异性表达，且miR-150-5p 靶向结合于SOCS1 mRNA。miR-150-5p 可能作为RA 疾病诊断、中医证型判断的有力指标，可为“病”“证”结合的诊断提供参考。本研究存在一定的不足，即样本量较小，可能存在一定的偏倚。因此，需谨慎解读本研究结果。下一步，需结合基因芯片技术，扩大样本量，发现更多特异性miRNAs，从而为RA的疾病诊断及中医证型判断提供更多更确切的客观证据。