三仁汤对脾胃湿热型大鼠NLRP3、Caspase-1蛋白的影响＊

彭林佳，刁建新，薛文秀，蓝惠璇，谢俊雄，韩嘉璐，曾宇乔，文小敏

（南方医科大学中医药学院 广州 510080）

脾胃湿热证是脾胃系统疾病中常见的证型之一，主要临床表现为腹胀腹痛、恶心呕吐等脾胃系症状。长期的临床与实验研究表明，脾胃湿热证型中胃黏膜细胞病理改变存在着十分密切的关系。经典的细胞焦亡的激活主要以Caspase-1 为核心，NLRP3 与凋亡相关斑点样蛋白结合，形成炎性小体并激活Caspase-1，Caspase-1 介导细胞因子、炎症因子的活化，最终形成“瀑布效应”、“级联效应”，放大炎症反应，导致剧烈的炎症反应发生，从而介导细胞发生焦亡。[1-6]中药复方三仁汤出自清代吴鞠通《温病条辨》，主治湿热流连三焦，暑温夹湿，湿重于热的症候，具有清利湿热，宣畅气机的作用。本文建立脾胃湿热证大鼠模型，用三仁汤进行治疗，并监测NLRP3 与Caspase-1 蛋白表达水平，旨在揭示脾胃湿热证大鼠胃黏膜是否发生细胞焦亡，三仁汤可能通过影响大鼠NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达而影响细胞焦亡。中医认为，肝胆主气机的升发与疏泄，脾主升清，胃主降浊，同居中焦，共同斡旋气机的升与降。脾的运化有赖于肝气的条达，肝能藏血，脾能统血。而肝的疏泄、藏血又需脾胃化生精微来供养。如果脾胃运化功能失常，中焦气机不运，脾胃对谷食、水蚀运化吸收不好，湿浊就会内生，失于升清和降浊。气机壅塞同样会波及肝胆，使肝胆疏泄不利而出现胁肋疼痛，胆汁分泌不畅逆行反流，甚至出现黄疸。一般对于急性肝衰竭的研究局限于肝脏本身，但是根据中医的理论，脾胃疾病同样能够影响肝脏的功能，故本文通过研究三仁汤可能通过影响大鼠NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达而影响细胞焦亡，从而为探讨脾胃湿热证与急性肝衰竭的关系打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及饲养

购自南方医科大学实验动物中心的SPF 级雄性SD 大 鼠50 只，体 质 量（200 ± 20）g，合 格 证 号:4402102032，饲养于SPF 级环境内，室温20-24℃，湿度55%-65%，自由饮水和摄食；高糖高脂饲养。

1.1.2 中药制备

三仁汤出自中医经典《温病条辨》，组成包括苦杏仁15 g，法半夏15 g，生飞滑石18 g，薏苡仁18 g，白蔻仁6 g，川厚朴6 g，白通草6 g，淡竹叶6 g，于南方医科大学南方医院中药房购买，并经南方医科大学中医药学院中药鉴定室鉴定，按传统方法将中药加水720 mL（按现代药理学方法，煎药水量是中药质量的8 倍）浸泡30 min，武火煮沸，文火再煎煮40 min，连续两次，去渣合并，依据《中药药理研究方法学》[7]中人与大鼠剂量换算公式（大鼠按每只200 g 体质量计算），低温浓缩成高中低三个浓度，分别为16.4 g·kg-1、8.2 g·kg-1、4.1 g·kg-1，4℃冰箱保存。

1.1.3 试剂与菌种

苏木素、伊红、磷酸盐缓冲液、抗Actin 多克隆抗体、抗兔二抗、抗鼠二抗均购于北京中杉金桥生物试剂有限公司；抗兔NLRP3、Caspase-1 多克隆抗体购于美国abcam公司。总蛋白提取及定量试剂盒购于美国Pierce 公 司，ECL 发 光 液 购 于 美 国Merck Millipore 公司。由南方医科大学微生物实验室提供，浓度为1X 109n/ml的侵袭性大肠杆菌。

1.1.4 实验仪器

德国莱卡石蜡切片机，PL303型梅特勒电子天平，日本尼康Eoipse Ti-s 荧光倒置显微镜及分析软件，美国Thermo 全波段酶标仪，Bio-Rad 公司转膜仪及PVDF膜。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模

将50只SPF级雄性SD大鼠随机分成5组，分别为正常对照组、脾胃湿热模型组、三仁汤低、中、高剂量组，每组10 只。造模组大鼠造模前禁食12 h，自由饮水。除正常对照组，其它各组给予肥甘饮食饲料（在普通饲料中混入12%猪油，8%蜂蜜）喂养10天。然后置于仿真模拟气候仓（环境设置为：温度33 ± 2℃，相对湿度（75 ± 5）%，每天干预2 小时）共8 天。第19 天开始按10 mL·kg-1给予大肠杆菌（109 CFU·mL-1）1 次灌胃，24 h 后再加强感染1 次（5mL·kg-1），移出置于自然环境，建立脾胃湿热证大鼠模型。病理确认以后，给予三仁汤高、中、低剂量，分别给以16.4 g·kg-1、8.2 g·kg-1、4.1 g·kg-1浓度的三仁汤灌胃，连续灌胃7天。

1.2.2 标本获取

大鼠处死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.35 mL·100 mg-1腹腔注射麻醉，迅速打开腹腔。①腹主动脉采血，3000 r·min-1，离心15 min，-80℃保存。②取胃组织分成2分，1份冻存于-80℃冰箱，进行后续的蛋白质免疫印迹检测，另一份保存于4%多聚甲醛溶液，进行后续的病理切片染色。

1.2.3 病理形态学观察

取胃组织，用10%甲醛固定，按照常规脱水，石蜡包埋，切片4µm 的厚度，60℃烤片，进行苏木精-伊红染色。每只大鼠胃组织制作1 张切片，随机选取5 个高倍镜视野进行观察。应用Nikon Eoipse Ti-s 倒置显微镜分析图像。

1.2.4 蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测NLRP3、Caspase-1蛋白的表达量

秤取50 mg 胃组织, 按Pierce 总蛋白提取说明操作进行蛋白裂解，BCA 法进行蛋白定量，取蛋白50µg，在12% SDS-PAGE 电泳, 然后转至硝酸纤维膜（Millipore 公司），5%脱脂牛奶置于摇床室温孵育1 h，分别加入抗兔NLRP3、Caspase-1 多克隆抗体（1：1000稀释）、兔抗小鼠Actin 抗体（1：1000 稀释），4℃孵育过夜，TBS-T 洗3 次，每次5 分钟。加入HRP 标记的抗兔二抗（1:2000 稀释）和HRP 标记的抗小鼠二抗（1:2000稀释），置于4℃冰箱孵育1 h，TBS-T 洗涤3 次，每次5分钟。将膜用ECL 化学发光液孵育1 min 后曝光，并用Kodak 2000MM 图像工作站成像，以NLRP3、Caspase-1 光密度值与Actin 光密度值的比值表示NLRP3、Caspase-1的相对表达水平。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件包进行统计分析，数据均采用“均数±标准差”表示，多样本均数比较采用One-Way ANOVA 方差分析，组间多重比较若符合方差齐性检验时用LSD法，计量资料以（±s）表示，若方差不齐则用TamhaneT2法。P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 三仁汤对脾胃湿热消化病病理结果

观察三仁汤对脾胃湿热消化病病理结果发现，脾胃湿热大鼠病理炎症细胞渗出，胃腺体脱落、减少、萎缩，具有坏死和凋亡的特征，同时出现细胞膜失去完整性的形态学特征，即细胞焦亡的病理特征。另外，三仁汤（高、中、低剂量）组的胃黏膜细胞焦亡有所改善，镜下可见胃黏膜炎症细胞渗出减少，胃腺体脱落情况相对改善，数量与模型相比明显增多，胃黏膜腺体萎缩的情况也有好转。（见下图）

2.2 三仁汤对脾胃湿热相关消化病NLRP3、Caspase1蛋白的影响

通过免疫印迹对NLRP3、Caspase-1 进行定性与定量的测量，可以发现三仁汤高、中、低剂量组的NLRP3 与Caspase-1 的表达与模型组相比均有所下降。差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

中药复方三仁汤出自清代吴鞠通《温病条辨》，原文上篇第43 条云:“头痛恶寒，身重疼痛，舌白不渴，脉弦细而濡，面色淡黄，胸闷不饥，午后身热，状如阴虚，病难速愈，名曰湿温。汗之则神昏、耳聋，甚则目瞑不欲言，下之则洞泄，润之则病深不解，长夏深秋冬日同法，三仁汤主之。”方中滑石清热利湿而解暑；薏苡仁淡渗利湿以健脾，使湿热从下焦而去；白豆蔻芳香化湿，利气宽胸，畅中焦之脾气以助祛湿；杏仁宣利上焦肺气；通草、竹叶甘寒淡渗，助滑石利湿清热之效；半夏、厚朴行气除满，化湿和胃。[8]主治湿热留恋三焦，暑温夹湿，湿重于热的证候，具有清利湿热，宣畅气机的作用。古代医家对于脾胃湿热证的论述始于秦汉时期。《黄帝内经》论述了脾、胃与湿、热邪之间的关系，并未将湿热与脾胃直接联系起来。古代医家对于脾胃湿热的进一步认识在晋隋宋元时期，《诸病源候论·卷三十》云：“口吻疮候，足太阴为脾之经，其气通于口。足阳明为胃之经，手阳明为大肠之经，此二经脉交并于口。其腑脏虚，为风邪湿热所乘，气发于脉，与津液相搏，则生疮”。[9]脾胃湿热的理论在明清时期得到完善。《赤水玄珠·卷十一》云：“手足汗乃脾胃湿热内郁所致，脾胃主四肢”。[10]现代药理学研究与临床实践证明表明，三仁汤具有治疗急性胃肠炎、慢性萎缩性胃炎、消化不良、急慢性腹痛等作用。[11-22]脾胃湿热证在临床上主要表现为中上腹胀、嗳气、呃逆、反酸等症状。本实验HE 染色结果显示，模型组胃黏膜活动性炎症，胃黏膜充血、水肿和溃疡，胃腺体萎缩、减少、脱落，细胞膜失去完整性的形态学特征，脾胃湿热型大鼠可能发生了细胞焦亡，引起了炎症的爆发，从而引起慢性胃炎，通过用三仁汤高、中、低剂量和奥美拉唑进行干预，与模型组相比，胃黏膜炎症细胞的渗出明显减少，胃黏膜腺体方面，腺体明显增多、萎缩情况减少的。与奥美拉唑组相比，三仁汤高、中、低剂量组胃黏膜炎症与胃黏膜腺体情况也是有所改善的，这表明三仁汤对于脾胃湿热证有着明显的改善作用。

细胞焦亡是目前研究得较为热门的细胞坏死模式，其显著特征之一为细胞膜完整性明显丧失，并释放胞浆中促炎性细胞内容物，诱发炎症反应。[6]细胞焦亡是由一系列能形成炎性小体的模式识别受体所触发，这些模式识别受体包括NOD 样受体NLRP1、NLRP3 等，它们通过识别同源配体的方式与凋亡相关斑点样蛋白结合，形成一个大分子复合物，趋化Caspase-1 形成炎性小体，并激活Caspase-1，成熟的Caspase-1促进炎症因子的释放，诱导细胞焦亡。[2,6,23-25]细胞焦亡最突出的特点是依赖于Caspase-1 的激活，这种依赖于Caspase-1 的细胞死亡方式称为经典途径细胞焦亡。[26]Caspsae-1 是细胞焦亡过程极为重要的关键蛋白。随着研究的深入，人们发现Caspase-1 诱导的细胞焦亡是由一系列能形成炎性小体的模式识别受体所触发。这些模式识别受体包括NOD 样受体（NOD-like receptors，NLRs）NLRP1、NLRP3 和NLRC4/NAIP 及黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）等，它们通过识别同源配体的方式与凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）结合，形成一个大分子复合物，趋化Caspase-1 形成炎性小体，并激活Caspase-1，成熟的Caspase-1 促进白细胞介素1β（interleukin 1-β，IL-1β）和白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）的成熟，诱导细胞焦亡，炎性体（inflammsome）的形成是细胞焦亡的一个重要特征。[1-2,23,27-31]研究表明，细胞焦亡在多种疾病的发生发展过程中都发挥着重要的推动作用。[25,32-46]本实验结果显示，与模型组相比，三仁汤高、中、低剂量组下调脾胃湿热证大鼠胃黏膜NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达，脾胃湿热大鼠引起的细胞焦亡，可能受到NLRP3、Caspase-1蛋白的调控。

综上所述，三仁汤可能通过下调脾胃湿热大鼠的NLRP3、Caspase-1蛋白的表达，减少胃粘膜细胞焦亡，从而抑制胃粘膜炎症的爆发，从而防治脾胃湿热证模型大鼠，为临床治疗脾胃湿热证的胃痛提供了理论依据。