新蒲饮联合奥美拉唑对Hp相关性胃炎及TLR4/JAK2/STAT3通路的影响＊

汪吴珺，刘智群，杨 勤，金小晶＊＊

（1. 南京中医药大学 南京 210000；2. 南京中医药大学附属南京中医院 南京 210000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种革兰氏阴性细菌病原体，易定植于胃粘膜，部分感染者会发展成慢性浅表性胃炎[1]。存在于Hp 表面的脂多糖（LPS）被认为是引起Hp 感染的主要致病因子，其具有很 强 的趋化作用[2]。Kawahara 等[3]发现Hp 和LPS 可刺激豚鼠胃窦细胞Toll样受体4(TLR4)的表达，并诱导其中的炎症反应。

TLR4 是一种跨膜蛋白，属于模式识别受体家族。TLR4 可以识别LPS 并激活NF-kB 等炎性细胞因子产生[4]。Alvarez-Arellano L 等[5]经试验证明，人感染Hp后，胃黏膜上可检测到TLR4 表达增加。JAK2 可通过保守的JAK-STAT 细胞信号传导途径发出信号[6]。实验证明，Hp 含有的LPS 能够募集和激活JAK2，从而催化p-STAT3[7]。因此，STAT3激活的一种新机制可能是通过TLR4/JAK2/STAT3。TLR4 能够通过诱导炎症因子的产生来激活JAK2/STAT3。

因此，本研究通过构建小鼠Hp 相关性胃炎的模型，并给予不同的药物治疗，观察治疗前后Hp 感染的疗效及TLR4/JAK2/STAT3 含量变化情况，探讨新蒲饮联合奥美拉唑治疗Hp相关性胃炎的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物品系及菌株

SPF级6-8周C57BL/6（B6）小鼠50只，每组10只，雌雄各半，体质量（20 ± 2）g，室温保持在（22 ± 2）℃，相对湿度为65%，按正常昼夜节律调整光照时间。小鼠由江苏省中医院药理实验室（SYXK（苏）2017-0069）提供，实验小鼠的饲养及组织取材均在江苏省中医院药理实验室进行。

HpSS1（Helicobacter pylori Sydney strain 1）菌株由江苏省人民医院消化科惠赠，接种于哥伦比亚培养基（加入10%的脱纤维羊血），培养时的气体条件为5%O2、10%CO2和85%N2，培养48-72 h，逐日观察结果，培养物经快速尿素酶试验判定阳性。

1.2 药物

新蒲饮由川连6 g、蒲公英20 g、木香10 g、连翘20 g、槟榔10 g、百合30 g、生甘草9 g 组成，药材均购于南京中医药大学附属南京中医院。将上药浸泡、煎煮2次、取汁,去除残渣,4℃保存。奥美拉唑肠溶胶囊，常州四药制药有限公司,批号：H10950086。阿莫西林胶囊，珠海联邦制药股份有限公司,批号：H20003263。克拉霉素分散片，扬子江药业集团有限公司，批号：H9990376。

1.3 主要试剂与仪器

恒温培养箱，型号：HWS-250，采购自上海精宏公司；超净台，型号：VS，采购自AIRTECH 公司；制冰机，型号：SIM-F40AY-P，采购自日本松下公司；烘箱，型号：MDL115，采购自德国Binder公司；酶标仪，BioTek，型号：XSZ-02；Cari Zeiss 倒置显微镜，型号：Primovert，采购自Cari Zeiss公司；离心机，LDZ5-2，采购自Beijing Medical Centrifuge Factory 公司。

2 实验方法

2.1 模型建立

适应性饲养5 天，第6 天禁食12 小时后用灌胃器喂以5%NaHCO30.5 mL。15 min 后灌入菌液0.3 mL，2小时后给食。隔日一次，共3 次。感染后定植4 周。4周后每组取出2只小鼠进行尿素酶检测以及吉姆萨染色观察小鼠感染情况。

2.2 实验分组

模型建立后，将50 只C57BL/6（B6）小鼠随机分成对照组（10 只）、模型组（10 只）和给药组（30 只）。将30 只给药组小鼠随机分为纯中药组、中西结合组、西药组，小鼠连续给药14天；对照组、模型组小鼠连续生理盐水灌胃14天。2 周后各组随机抽取2只小鼠做病理切片观察炎症情况，模型组、纯中药组、中西结合组、西药组各小鼠以快速尿素酶法检测胃组织Hp 感染，做吉姆萨染色观察Hp分布及定植情况。

2.3 给药

根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”直接换算，新蒲饮水煎后配制成浓度为0.68 g/mL的混悬液；用蒸馏水将奥美拉唑片配成浓度为0.26 mg/mL的混悬液、浓度为6.5 mg/mL的克拉霉素混悬液、浓度为13 mg/mL 的阿莫西林混悬液，纯中药组灌注新蒲饮混悬液；中西结合组灌注奥美拉唑混悬液30 min后，再灌注新蒲饮混悬液；西药组先灌注奥美拉唑混悬液，30 min 后再灌注克拉霉素混悬液及阿莫西林混悬液，对照组与模型组灌注生理盐水。给药体积：灌胃0.1 mL/10 g,一天2次。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 快速尿素酶检测

取胃窦部小弯侧组织一块行快速尿素酶试验，具体方法参照Hp 快速诊断试剂盒（尿素酶法）使用说明书，5 min 内试剂由黄色变红且红晕扩散，则尿素酶试验阳性。

2.4.2 吉姆萨染色法

将取出的胃黏膜标本经石腊包埋、切片。Giemsa染色方法[8]如下:①常规脱腊进水,流水冲洗至切片清晰;②直接入1%Giemsa 染液中染色20-30min;③自来水洗去染液后直接入95%乙醇中分化后;④100%乙醇脱水;⑤常规透明(二甲苯),中性树胶封片。高倍镜(400倍)下找Hp,镜下见典型细菌(呈小的短杆状,稍弯曲紫兰色)者诊断为Hp 阳性,Hp 感染的程度主要根据其累及的范围判定。按悉尼系统规定轻、中度为单个细菌或少量细菌,累及范围少于2/3 活检材料;重度为大量细菌累及范围大于2/3 活检中的胃腺窝;在本研究中，将未发现细菌感染的定为阴性，轻、中度定为弱阳性，重度定为阳性。

所有患者干预前、干预后6个月使用中文版糖尿病自我管理行为量表进行评价。干预前由研究小组成员当场发放并收回，干预后6个月时与患者电话随访时进行量表的填写及回收。

2.4.3 免疫组化评估TLR4、p-JAK2、p-STAT3

图1 各小鼠胃组织粘膜Hp定植及炎症情况

将组织样本在10%甲醛中固定24 小时并石蜡包埋。使用高温抗原去掩蔽技术使去石蜡化的组织载玻片进行抗原修复。使用以下一抗：兔多克隆抗体抗TLR4（bs-1021R,1：100 稀释;Bioss Antibodies）、兔多克隆 抗 p-STAT3（bs-1658R, 1：100 稀 释; Bioss Antibodies）和兔多克隆抗p-JAK2（bs-1658R,1：100 稀释; Bioss Antibodies）。通过应用生物化三乙基二抗（Vectastain Universal Elite ABC Kit，Peterborough，United Kingdom）30 分钟检测结合的抗体。所有样品均由两位独立的病理学家进行读片。

2.4.4 蛋白质印迹分析

制备细胞裂解物，并通过BCA 蛋白质测定试剂测量蛋白质浓度。将等量的蛋白质（10-30µg）在8%或12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到PVDF 膜上。将转移的蛋白质在含有0.1%吐温20（PBST）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的5%无脂奶粉中在室温下封闭2小时。然后，将膜与含有3%无脂奶粉的一抗在PBS 中在4℃温育过夜。洗涤膜，然后用1：3000 稀释的各HRP-缀合的二抗孵育2 小时，并再次用PBST 洗 涤。TLR4、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、GAPDH 抗体均购买自Abcam 公司。用ECL 化学发光检测试剂盒显示表达的蛋白质。

2.5 统计分析

通过SPSS 软件（版本22.0）和GraphPad Prism（版本5.0）进行统计学分析。定量数据表示为平均值±SD。通过Student's t 检验分析两个样品的平均值的差异。P<0.05显示差异有统计学意义。

表1 小鼠胃组织吉姆萨染色法检测结果

3 结果

3.1 Hp治疗效果

3.1.1 快速尿素酶结果

统计后可发现，对照组Hp 感染阳性0 例；模型组阳性8例；纯中药组阳性4例，阴性4例；中西结合组阳性3例，阴性5例；西药组阳性2例，阴性6例。

3.1.2 吉姆萨染色结果

电镜下显示：对照组未见明显的Hp 聚集，相比之下，模型组胃黏膜表面可见大量的Hp 聚集成簇，呈稍弯曲紫兰色、小的短杆状；纯中药组可见部分Hp 聚集成团，中西结合组和西药组仅可见少量散在的Hp。见表1、图1。

3.2 胃组织病理观察

图2 各组小鼠胃黏膜组织病理形态学比较(HE染色,×400)

图3 各组小鼠黏膜组织TLR4、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达（与对照组相比，#P<0.01，与模型组比较，*P<0.05）

本研究通过HE 染色法观察各组之间胃组织病理变化情况。光镜下显示：对照组小鼠胃黏膜上皮细胞完整，固有层内有密集排列的腺体，个别小鼠胃黏膜底部可见少量散在的淋巴细胞，较少的炎性细胞浸润到胃粘膜中；模型组细胞排列紊乱，粘膜下可见较明显的血管扩张充血肿胀，并伴有大量嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞存在于细胞间质中，甚至可见部分组织腺体萎缩及不同程度的异型性；与模型组相比，纯中药组血管充血肿胀有所缓解，散在的炎症细胞减少；中西结合组和西药组细胞排列整齐，粘膜下血管稍有充血，仅见少量散在的炎症细胞。见图2。

3.3 不同治疗方案对TLR4/JAK2/STAT3 信号通路的影响

首先，本研究提取各组小鼠胃黏膜蛋白进行免疫组化分析和Western Blotting。与对照组相比，模型组胃粘膜蛋白TLR4 表达明显增加，而JAK2 与STAT3 表达没有明显改变，但p-JAK2 与p-STAT3 表达显著升高，与模型组相比，治疗组的TLR4、p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达量都相应减少，而JAK2、STAT3 的表达量未见明显变化。与纯中药组相比，中西结合组TLR4、p-JAK2、p-STAT3 的蛋白表达更低，提示中西结合组降低TLR4、p-JAK2、p-STAT3 作用更强。西药组与中西结合组TLR4、p-JAK2、p-STAT3 之间的变化无统计学差异，提示中西结合组与西药组效果相当。结果见图3。

免疫组化结果示：对照组小鼠胃黏膜组织未见TLR4、p-JAK2、p-STAT3 表达；模型组可见TLR4、p-JAK2、p-STAT3 有大量阳性表达；经不同方案治疗后，中西结合组和西药组相较于模型组，小鼠胃黏膜组织TLR4、p-JAK2、p-STAT3 表达明显减少，纯中药组也可见表达量减少，但减少程度不明显。见图4～6。

4 讨论

图4 各组小鼠胃黏膜组织TLR4蛋白表达(免疫组化染色,×400)

图5 各组小鼠胃黏膜组织p-JAK2蛋白表达(免疫组化染色，×400)

图6 各组小鼠胃黏膜组织p-STAT3蛋白表达(免疫组化染色，×400)

目前，Hp 是公认的引起胃部炎症的主要致病因素[9]，胃炎的炎症程度不仅与胃黏膜上Hp 的分布密度和数量相关，同时也可因Hp 菌株释放大量的空泡毒素，损害胃上皮细胞空泡，从而加速胃黏膜炎症形成[10]。Hp 相关性胃炎在中医中没有正式的病名，大多根据患者的主要症状归类于“痞证”“吞酸”“嘈杂”等[11]。随着研究中药治疗Hp 相关性胃炎主要机理的程度不断加深，研究药物从单味药到中药复方，研究方法从体外药效研究到体内药效研究，研究层面从组织水平到细胞分子水平，都证明了中医药在治疗Hp感染相关性疾病中起着一定的积极作用[12-14]。

中国第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告中指出可以应用中药联合西药，作为根除Hp 感染的探索治疗方法，并提出“中西结合”这一术语[15]。近年来许多研究结果表明，与单纯应用西药或中药治疗相比，“中西结合”在治疗Hp 相关性胃炎方面能够充分结合两者优点，有效提高Hp 根除率，改善患者临床症状[16]。因此，本研究通过建立Hp相关性胃炎小鼠的模型，并分别给予新蒲饮、新蒲饮联合奥美拉唑及西药三联治疗后，观察不同给药方法对Hp清除的疗效。

早期研究表明TLR4 活化是由细菌分泌的LPS 引起的细菌感染引起的[17]。且大量存在于多形核细胞，巨噬细胞，T 细胞和B 细胞中[18]。炎症细胞中的TLR4信号传导可能导致促炎细胞因子，免疫抑制细胞因子的产生[19]。有研究表明，TLR4的活化促进复杂信号通路的激活，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）（p38，JNK 和ERK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和GTP 酶[20]。Janus激酶中JAK2是细胞增殖、分化、存活和衰老的重要因子。JAK2 还调节其他信号分子，包括RAS，信号转导和转录激活因子（STAT）等[21]。STAT3 是STAT 家族的成员，JAK2 一旦被激活，其自身的磷酸化（p-JAK2）可与STAT3 创建对接位点，从而激活诱导STAT3 的磷酸化（p-STAT3）[22]。p-STAT3 可形成二聚体并易位至细胞核并调节参与促进细胞存活的靶基因（例如，c-Myc）的转录[23]。然而Hp 介导的STAT3 激活的分子机制尚未完全清[24]。有报道显示，Hp 阳性的胃炎患者表现出p-STAT3 增加，并且随着Hp 的根除，这些患者中p-STAT3 的表达显著降低，提示p-STAT3在Hp 相关性胃炎中的重要作用[25]。有研究表明可通过抑制JAK2/STAT3 磷酸化从而抑制TLR4 的信号通路，最终抑制炎症反应的发生[26]。综上所述，本研究使用新蒲饮联合奥美拉唑治疗Hp 相关性胃炎，可通过抑制TLR4 的活化，进而抑制JAK2、STAT3 的激活，最终减少炎症反应的发生。

实验通过快速尿素酶检测以及病理吉姆萨染色证明小鼠造模成功。首先，统计小鼠治疗前后灭幽情况，分析不同药物对Hp 的清除效果；其次，观察胃粘膜中TLR4、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 变化情况，分析新蒲饮联合奥美拉唑对Hp 相关性胃炎TLR4/JAK2/STAT3 通路的影响。经药物治疗干预后，相较于模型组，纯中药组、中西结合组以及西药组胃组织蛋白中的TLR4、p-JAK2、p-STAT3 含量都有不同程度的降低，而JAK2、STAT3的含量均未见明显变化；中西结合组和西药组效果相当，TLR4、p-JAK2、p-STAT3表达低于纯中药组。

随着社会进步，人际交往越来越频繁，Hp 感染引起的相关性胃炎已经成为影响现代人生活质量的一个重要因素，因此，研究Hp 相关性胃炎的发生和治疗也受到越来越多的重视。通过我们的研究可以发现，新蒲饮联合奥美拉唑可以通过TLR4/JAK2/STAT3 通路治疗Hp相关性胃炎。