QuEChERS-液相色谱串联质谱仪检测猪肉中102种农兽药残留及非法添加物方法的研究

贝 峰 路 川 王乐勇 赵成新 杜海云 王 超 李建亮 周杨学 聂 梅

（①中华人民共和国泰安海关 山东 泰安 271000 ②中华人民共和国菏泽海关 山东 菏泽③山东省泰安市食品药品检验检测中心 ④山东农业大学动物科技学院 山东 泰安）

农药的无节制使用、兽药的滥用以及非法添加物的使用，不同程度威胁到广大人民群众饮食安全。QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法已经用于多种肉品中农兽药残留及非法添加物的检测[1-4]。本研究结合“农业部颁布的食品动物禁用的兽药及其它化合物清单”及近两年国内外动物产品风险预警清单，建立了国内外关注度较高的农药、兽药禁用药物及非法添加物名录。利用β-兴奋剂类、催眠、镇静类、有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂等102种农兽药残留及非法添加物可在EDTA溶液条件下被有机溶剂从生物检材中提取出来的特点，经QuEChERS方法净化[5]，再利用LC-MS/MS多反应监测分析，建立多反应监测模式(MRM)的选择离子数据库[6]。以保留时间、母离子/子离子对进行定性分析；以定量离子对峰面积进行定量。该方法可同时完成目标样品中目标残留物的检测，将大大提高检测效率，缩短检测时间，为食品中农兽药残留及非法添加物等多组分同时快速检测的标准方法的建立提供参考，具有极大的经济和社会效益。

1 材料与方法

1.1 实验材料

猪肉来自泰安某出口加工企业。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 三重四极杆液相色谱质谱联用仪(美国赛默飞世尔公司, TSQ Quantum Access MAX)、电子天平(0.1mg，梅特勒PB153-S)、粉碎机(IKA T18，广州IKA公司)、高速台式冷冻离心机(3k15，德国Sigma公司)、旋转蒸发仪(Buchi R-215，瑞士步琪公司)、漩涡震荡仪(MS1，广州IKA公司)。

1.2.2 试剂 乙腈(色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司)、甲醇(色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司)、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)。

1.2.3 农兽药残留及非法添加物 102种农兽药残留及非法添加物分别为：普鲁卡因、沙丁胺醇、磺胺嘧啶、呋虫胺、噻虫嗪、磺胺二甲嘧啶、克伦特罗、多菌灵、敌敌畏、百治磷、可卡因、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、吡虫啉、噻菌灵、啶虫脒、噻虫胺、苯嗪草酮、磺胺喹恶啉、噻虫啉、磷胺、醚苯磺隆、盐酸异丙嗪、苯线磷砜、速灭威、灭草松、苯线磷砜、恶虫威、克百威、抑霉唑、甲萘威、氯丙嗪、环嗪酮、乙拌磷亚砜、丁苯吗啉、螺环菌胺、乙拌磷砜、乙硫苯威、丰索磷、氯虫苯甲酰胺、异丙隆、甲霜灵、氟磺胺草醚、蔬果磷、苯硫磷、仲丁威、氟酰胺、咯菌腈、啶酰菌胺、莠灭净、乙霉威、烯酰吗啉、利谷隆、稻瘟灵、氟硅唑、嘧霉胺、多杀菌素A、多杀菌素D、地西泮、苯线磷、苯氧威、三唑磷、甲胺基阿维菌素、戊菌唑、杀铃脲、除虫脲、茚虫威、异稻瘟净、丙森辛、稻丰散、磺胺邻二甲氧嘧啶、治螟磷、氟铃脲、氯苯嘧啶醇、甲草胺、异丙甲草胺、苯霜灵、吡唑醚菌酯、戊唑醇、二嗪磷、伏杀硫磷、咪鲜胺、虱螨脲、四螨嗪、地虫硫磷、甲基嘧啶磷、硫线磷、乙硫磷、益棉磷、噻嗪酮、唑虫酰胺、嘧啶磷、噻螨胺、蚊蝇醚、增效醚、噻螨酮、虫酰肼、唑螨酯、螺螨酯、哒螨灵、克螨特、喹螨醚。

1.2.4 标准工作液 农药和兽药标准溶液(浓度100µg·mL-1，购自北京坛墨质检科技有限公司)、非法添加物标准溶液(浓度10µg·ml-1，泰安市公安局刑事侦查中心提供)、标准品用乙腈(浓度100 mg·L-1的标准储备液，于4℃冰箱中避光保存)。将储备液用乙腈稀释至0.1mg·L-1、1.0mg·L-1、5.0mg·L-1、10.0mg·L-1和50.0mg·L-1浓度的系列标准工作溶液，于4℃冰箱中避光保存。

1.3 液相色谱-串联质谱条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis T3柱，2.1×150mm，3µm；进样量：10µl；柱温：25℃；流动相：0.1%(v/v)甲酸-20mmol/L甲酸铵水溶液(A)和0.1%(v/v)甲酸-20mmol/L甲酸铵甲醇溶液(B)，流速：0.3ml/min，洗脱梯度：在10min内B从10%升到90%，维持12min，0.5min内B降到10%平衡2min。

1.3.2 质谱条件 电喷雾电离源正离子电离模式(ESI)，喷雾电压：3500V；鞘气流速：30Units；辅助气流速：10Units；离子传输毛细管温度：350℃；源内碰撞诱导解离电压：1.5V；碰撞气：氩气，压力1.5mTorr。扫描模式：选择反应监测(SRM)，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见附表。

附表 部分农兽药残留及非法添加物LC-MS/MS测定参数

1.4 样品前处理

准确称取搅碎的猪肉2g(0.01g)于50ml塑料离心管内，加入2ml 0.1mol/L EDTA-2Na溶液，涡流混合1min，再加入8ml，涡流混合1min，超声处理提取20min，10000rpm离心5min；取上清液3ml转移至15ml塑料离心管中，加入100mg C18，50mg无水硫酸镁，涡流混合1min，5,000rpm离心5min，上清液进LC-MS/MS分析[7]。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择 102种农兽药残留和非法添加物的极性范围较大，选择C18、Atlantis HILIC和Atlantis T3色谱柱作为试验对象[8]。结果表明，102种物质在分离极性较小的C18色谱柱上保留时间长；在分离极性强的Atlantis HILIC柱上保留不住；而在分离极性界于两者之间的Atlantis T3色谱柱上，分析速度快，分离效果好。

2.1.2 流动相的选择 流动相中的有机相一般采用甲醇或乙腈。实验表明使用甲醇时，信号响应强且峰形较好。水相一般选择甲酸水溶液、甲酸铵水溶液或甲酸-甲酸铵水溶液[9]。通过试验比对，甲酸铵水溶液比较适合T3色谱柱的pH范围(2～8)，适量甲酸铵还可抑止拖尾现象。最终分析102种物质在T3色谱柱上可以获得良好的分离。

2.2 基质效应、线性范围、检出限

基质效应是在提取基质中的目标物时，基质中的干扰物影响目标化合物的离子化，使得目标化合物在仪器上的响应发生了增强或者抑制的现象[10]。为提高定量的准确度和可靠性，本实验采用空白基质添加不同浓度的102种混合标准溶液，在已优化的色谱与质谱条件下，以质量浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程及其相关系数。结果表明，102种物质的线性范围为0.01mg·L-1～1.00mg·L-1，相关指数r2为0.9913～0.9994；方法的最低检出限(S/N=3)为0.01～0.02mg·kg-1，定量限(S/N=10)为0.01～0.02mg·kg-1，方法的最低检出限远低于当前各国现行残留限量标准。

2.3 准确度和精密度

选用不含待测目标物的空白样品，通过3个不同浓度水平(n=6)的添加回收试验，考察方法的准确度和精密度，102种目标物的添加水平为0.01mg·kg-1、0.02mg·kg-1和0.1mg·kg-1，三个水平的加标回收率范围分别为77.8%～101.7%，81.4%～99.5%，83.2%～99.1%，相对标准偏差(RSD)范围分别为5.1%～9.53%，3.1%～7.3%，2.91%～6.8%，方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。

3 结论

本文建立了一种快速检测食品中102种农药残留、兽药残留及非法添加物的方法，该方法采用EDTA-2Na溶液络合，乙腈提取，QuEChERS方法净化，HPLC-MS/MS分析检测，可在2h内完成整个检测过程，操作简单、灵敏度高，线性关系、准确度和精密度等均符合方法学指标，提高了检测效率，降低了检测成本；可实现对动物源性食品中农兽药残留及非法添加物的快速筛选检测。为相关标准方法的建立提供了好的思路。