胞外三磷酸腺苷对铅胁迫下植物细胞损伤和过氧化氢及其清除酶水平的调节

曹佳鑫 达梦婷 庞海龙 贾凌云 冯汉青

(西北师范大学生命科学学院，兰州 730070)

近年来，由于矿产资源大规模开采、富含重金属污染物的无序排放以及含重金属的农药和化肥大量使用等因素，土壤和水体中重金属的含量水平不断增加。其中，铅是当前环境中最为常见且毒性最强的重金属污染之一[1]。

铅作为植物的非必需元素能够对植物产生毒害作用[2]。研究表明，铅会随着植物吸收矿物质营养时通过根部进入植物体内[3]，而过量的铅吸收会抑制植物种子萌发和幼苗的生长，引起植物根部中毒，进而造成发育迟缓并影响植物的形态建成[4]。细胞生物学的研究进一步发现，铅会抑制植物酸性磷酸酶、酯酶、过氧化物酶等多种酶的活性，并通过增加活性氧(ROS)的产生引起组织中的氧化压力，进而导致DNA的损伤、基因突变和膜质过氧化等一系列变化[5～6]。而植物也能够利用体内的抗氧化系统在一定程度上抵抗铅胁迫对植物造成的上述不良影响[7]。

三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosphate，ATP)是细胞内储存和供应能量的货币分子。传统观念认为，三磷酸腺苷通常存在于细胞内部，通过提供能量来维持机体的正常代谢和生存。然而，许多研究表明，动物、植物和微生物细胞内的三磷酸腺苷可以通过通道蛋白、囊泡运输等方式被释放到细胞外基质中，因而在细胞外基质中也存在三磷酸腺苷，即胞外三磷酸腺苷(extracellular ATP,eATP)[8]。在动物细胞中发现，胞外三磷酸腺苷能够通过作用于细胞膜上的特异性受体调控动物细胞或组织的多种生理活动，如平滑肌血小板的聚合、糖原的降解以及激素的释放等[9]。近年来，植物胞外三磷酸腺苷及其生物学功能的研究也越来越受到关注和重视。现有的研究表明，植物细胞能够通过ATP结合转运载体蛋白或膜泡运输的方式将细胞内的三磷酸腺苷释放到胞外[10～11]。进一步研究揭示，植物的胞外三磷酸腺苷也是一种重要的信号分子，能够通过受体介导的作用来调节植物的细胞活力、生长发育、抗病性、向地性等生理活动[12]；此外，胞外三磷酸腺苷还能够刺激Ca2+、活性氧、一氧化氮等信号分子的产生，且茉莉酸和乙烯合成相关基因的表达也被受到了胞外三磷酸腺苷的上游调控[13～15]。Choi等[16]已在拟南芥中鉴定出能特异性结合胞外三磷酸腺苷的受体蛋白，进一步明确了胞外三磷酸腺苷在植物中作为信号分子的角色。最新的研究证明，胞外三磷酸腺苷可以缓解盐胁迫引起的植物细胞死亡和呼吸抑制[17]。然而，在铅这一常见的毒性重金属胁迫发生时，植物胞外三磷酸腺苷在植物细胞中的生理学变化以及相应的生物学功能尚未见明确的报道。

基于此，本文以烟草悬浮细胞培养物为材料，探讨了在铅离子胁迫下胞外三磷酸腺苷的水平变化以及其对细胞损伤、H2O2(过氧化氢)含量及H2O2清除酶活性的调节。相信该研究将进一步丰富人们对铅胁迫下植物细胞内在生理学变化的认识，也有助于进一步了解胞外三磷酸腺苷的生理学功能。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用BY-2烟草悬浮细胞(NicotianatabacumL.cv.Bright Yellow-2)由香港中文大学姜里文教授馈赠。

1.2 方法

1.2.1 烟草悬浮细胞培养

将悬浮细胞置于补充了3%(质量百分数)的蔗糖和0.4 mg·L-1的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS[18]液体培养基(pH=5.8)(Sigma-Aldrich公司)中，在25℃黑暗的条件下振荡培养(振荡速率为130 r·min-1)。每7天吸取10 mL的细胞培养物转至100 mL新鲜的MS培养基中进行传代培养。所有操作均在无菌条件下完成。

1.2.2 悬浮细胞的处理

取一定体积的处于生长对数期的细胞悬液，以1∶5的体积比用去离子水稀释并摇匀，过滤后用去离子水洗涤1～2次并分别进行如下两组处理，第一组处理：将细胞分别置于30、100、200或400 μmol·L-1的Pb(NO3)2中，在25℃黑暗条件下振荡孵育5 h，以等体积去离子水处理的悬浮细胞液作为对照；第二组处理：将细胞分别置于30 μmol·L-1ATP、200 μmol·L-1Pb(NO3)2+30 μmol·L-1ATP或200 μmol·L-1Pb(NO3)2中，在25℃黑暗条件下振荡孵育5 h，以等体积去离子水处理的悬浮细胞液作为对照。

1.2.3 细胞损伤水平的测定

用伊文思蓝(Evans blue)定量检测细胞的受损程度。取1 mL处理后的细胞悬液，加入100 μL 0.25%(质量百分数)的伊文思蓝染液混匀染色8 min，之后在3 000 r·min-1下离心3 min后弃上清，加入1 mL磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞，于3 000 r·min-1离心3 min后弃上清以洗去未与细胞结合的染料。之后向细胞中加入1 mL 1%(质量百分数)的十二烷基磺酸钠溶液(50%甲醇配制而成)，混匀后在50℃恒温水浴中放置30 min，使细胞裂解。于10 000 r·min-1条件下离心10 min，取500 μL上清液，用蒸馏水稀释至3 mL，在595 nm处测定吸光值，以反映细胞的损伤程度[19]。

荧光素双醋酸酯(fluorescein diacetate,FDA)可与活细胞结合，并在被激发后释放出绿色荧光；碘化丙啶(Propidium iodide,PI)能穿过破损的细胞膜而对核染色，嵌入双链DNA后释放红色荧光。上述两种染料的双染可用于进一步定性检测细胞活力以及受损水平[20]。取415 μL处理后的细胞悬液，加入20 μg·mL-1的FDA和5 μg·mL-1的PI(Sigma-Aldrich公司)，在室温下黑暗培养10 min，加800 μL磷酸缓冲液(PBS)，在1 600 r·min-1下离心3 min，去上清液，将样品在激光共聚焦显微镜(Leica,sp8)下进行观察并成像。

1.2.4 胞外及胞内三磷酸腺苷水平的检测

三磷酸腺苷水平使用萤火虫尾部提取物(Sigma-Aldrich公司)测定。萤火虫尾部提取物的主要成分为荧光素和荧光素酶，三磷酸腺苷可与荧光素经荧光素酶催化发生反应并释放荧光，通过测定发光强弱测定三磷酸腺苷的水平[21]。取处理后的细胞悬液1 mL,在4 000 r·min-14℃条件下离心4 min，吸取上清液，进行胞外三磷酸腺苷水平的测定；在去除上清的细胞中加入100 μL ATP检测裂解液(Sigma-Aldrich公司)使细胞内ATP释放，于12 000 r·min-1条件下4℃离心5 min，上清液用于胞内三磷酸腺苷水平的测定。测定方法依照制造商说明书进行。

1.2.5 H2O2含量、CAT酶活性、POD酶活性的测定

H2O2含量、CAT酶活性、POD酶活性的测定分别采用过氧化氢含量检测试剂盒、过氧化氢酶活性检测试剂盒、过氧化物酶活性检测试剂盒(北京索莱宝公司)采用分光光度法定量检测。具体操作参考说明书进行。

1.2.6 统计学分析

以上测量取4次独立实验结果的平均值，并将数值表示为平均值±标准偏差。数据采用双总体t检验，检验在P<0.05水平上的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 Pb(NO3)2对细胞损伤水平和H2O2含量的影响

结果显示，随着Pb(NO3)2处理浓度的增加，细胞损伤水平呈显著性上升。其中，30和100 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理分别使得细胞损伤水平较之对照增加了1.21和1.95倍；而200和400 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理则使得细胞损伤水平进一步上升，较之对照分别增加了2.84和3.14倍(图1)。

图1 不同浓度Pb(NO3)2处理下的细胞受损水平 不同字母表示在P<0.05水平上具有显著性差异，下同。Fig.1 The level of cellular damage under the treatment with different concentrations of Pb(NO3)2 Different letters indicate significant differences at P<0.05,the same as below.

通过检测H2O2的含量变化发现，随着Pb(NO3)2处理浓度的增大，细胞H2O2的含量呈现先升高后降低的趋势。在30、100 μmol·L-1Pb(NO3)2处理下细胞H2O2含量较之对照显著性升高；在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理下，H2O2含量达到最大值，在400 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理下H2O2含量较之峰值有所下降，但仍高于对照(图2)。

图2 不同浓度Pb(NO3)2处理下细胞内H2O2水平Fig.2 The level of H2O2 under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

图3 不同浓度Pb(NO3)2处理下CAT活性变化Fig.3 The level of CAT activity under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

2.2 Pb(NO3)2胁迫对CAT和POD活性的影响

CAT和POD是植物细胞清除过氧化氢的主要酶类。本研究发现，随着Pb(NO3)2处理浓度的增加，CAT酶的活性表现出和H2O2含量相似的变化规律：在30、100、200 μmol·L-1Pb(NO3)2处理下，CAT酶的活性不断增加，在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理下达到最大值，较对照提高了5.8倍；而当Pb(NO3)2浓度达到400 μmol·L-1时，CAT酶的活性较之峰值有所下降，但仍显著性高于对照(图3)。

POD酶活性则随着Pb(NO3)2处理浓度的增加不断下降。与对照相比，在30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理下，POD酶活性分别降低了20%，41.7%，58.1%，65.1%，其差异均达到显著性水平(图4)。

图4 不同浓度Pb(NO3)2处理下POD活性变化Fig.4 The level of POD activity under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

图5 不同浓度Pb(NO3)2处理下细胞外三磷酸腺苷含量的变化Fig.5 The level of extracellular adenosine-5′-triphosphate under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

图6 不同浓度Pb(NO3)2处理下细胞内三磷酸腺苷含量的变化Fig.6 The level of intracellular adenosine-5′-triphosphate under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

图7 不同处理下细胞损伤水平的变化 A.伊文思兰染色法检测细胞损伤程度；B.FDA/PI染色法检测细胞损伤和活力程度Fig.7 The level of cellular damage under different treatments A.Detection of cell damage with Evansblue staining; B.Detection of cell damage and viabilityby FDA/PI staining

图8 不同处理下细胞内H2O2水平Fig.8 The level of H2O2 under different treatments

2.3 Pb(NO3)2胁迫对细胞外及胞内三磷酸腺苷含量的影响

如图5显示，随Pb(NO3)2胁迫浓度的增大，细胞外三磷酸腺苷含量不断降低。较之对照，30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2分别使细胞外三磷酸腺苷含量降低了24.8%、44.1%、52.6%、77.7%(图5)。而胞内三磷酸腺苷的含量则因Pb(NO3)2处理而有所增加：较于对照，30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理分别使细胞内三磷酸腺苷含量升高了0.297、2.73、2.02、2.84倍(图6)。

2.4 外源三磷酸腺苷对Pb胁迫诱导的细胞损伤和H2O2积累的影响

如图1～4的结果所示，在200 μmol·L-1Pb(NO3)2处理下，细胞的H2O2含量达到了最大值，提示了该浓度Pb(NO3)2的处理使得细胞处于最大的氧化压力。因此，本研究选择了在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理的细胞中以探究铅胁迫下胞外三磷酸腺苷对细胞损伤和H2O2以及H2O2清除酶的可能影响。

结果表明，对未经过Pb(NO3)2胁迫的细胞加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷未引起细胞损伤和H2O2含量的显著性变化(图7～8)。较之200 μmol·L-1Pb(NO3)2处理的细胞，在Pb(NO3)2处理的细胞中加入30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷明显缓解了细胞损伤和H2O2含量的上升。PI和FDA的双染实验所得结果和伊文思蓝法检测结果基本一致。

2.5 外源三磷酸腺苷对Pb(NO3)2胁迫下CAT酶和POD酶活性的影响

由图9可知，对未经过Pb(NO3)2胁迫处理的悬浮细胞中加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷使得CAT酶活性略有上升，但没有达到显著性水平；相似的，对未经过Pb(NO3)2胁迫处理的悬浮细胞中加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷也没有显著改变POD酶的活性。

相较于200 μmol·L-1的Pb(NO3)2处理的细胞，在Pb(NO3)2处理的细胞中加入30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷使得CAT酶活性显著性下降，并使得POD酶活性显著性升高(图9～10)，表明外源三磷酸腺苷对铅处理下H2O2清除酶活性具有明显的调节作用。

图9 不同处理下CAT酶活性的变化Fig.9 The level of CAT activity under different treatments

图10 不同处理下POD酶活性的变化Fig.10 The level of POD activity under different treatments

3 讨论

目前，铅离子对植物造成的毒害作用是植物生理与生态学研究的重点问题之一[1～4]。本研究发现，在Pb(NO3)2处理下，细胞损伤水平随铅离子胁迫浓度的增大而上升(图1)；同时，细胞H2O2的含量也呈现出增大的趋势(图2)。已有研究表明，铅等重金属胁迫会引发植物细胞活性氧水平的上升，进而导致细胞膜损伤，以及影响核酸、蛋白质等大分子受损，并进而诱导细胞死亡[4]。而在细胞产生的活性氧当中，H2O2具有最长的半衰期以及穿膜的功能，因而对植物产生的氧化压力具有范围广、持续时间长的特点，其过量产生是许多生物性和非生物性胁迫导致植物细胞损伤的重要原因[22～24]。所以推测在铅胁迫下细胞损伤程度的上升也和H2O2积累密切相关。

CAT和POD是细胞内主要的H2O2脱毒酶类:CAT能够在过氧化物酶体、细胞质和线粒体中将H2O2分解为水和氧气分子[25]；而POD则通过H2O2为电子受体催化酚类等物质氧化从而减少了细胞H2O2的水平[26]。本文通过检测上述两种酶的活性变化发现，随Pb(NO3)2处理浓度增加，CAT酶活性呈现出和H2O2含量变化相同的趋势；而POD则呈现出不断减小的趋势。这与黄金秋等[27]在外源H2O2处理下水稻悬浮细胞中CAT和POD活性变化规律相似。一方面，这表明了在Pb胁迫下，H2O2清除酶的活性发生了明显的变化，不同的H2O2清除酶对于氧化压力的敏感程度和响应规律有所不同；另一方面，在Pb胁迫下CAT酶活性和H2O2含量变化的相似性提示了CAT较之POD在细胞调节H2O2水平中可能扮演着更为主要的角色。此外，有研究表明，当植物体内由重金属及其所诱导的ROS含量达到一定水平时可引起抗氧化酶失活，酶合成减少或者酶亚基装配发生改变[28～29]。因此，在Pb胁迫下CAT和POD酶活性变化的不同也可能反应了两种酶对于铅及其所诱导的氧化压力的耐受度有所不同。

以前的诸多工作报道，当植物细胞遭受铅等重金属胁迫时，植物需要产生更多的能量以增加离子的转运并产生能够特异性结合重金属的多肽以缓解重金属的毒性[30]。本研究也观察到Pb(NO3)2胁迫导致了胞内三磷酸腺苷水平的升高(图6)。然而有趣的是，尽管细胞外三磷酸腺苷来自于细胞内的三磷酸腺苷，但Pb(NO3)2胁迫下胞外三磷酸腺苷水平则呈现出下降趋势(图5)。这表明，细胞外和细胞内的三磷酸腺苷的水平至少在Pb胁迫下是被细胞独立调控的。推测Pb可能是通过影响通道蛋白或是囊泡运输等方式降低了胞外三磷酸腺苷从细胞内向细胞外的输送所致。

由于在200 μmol·L-1Pb(NO3)2处理下细胞处于最大的氧化压力，我们继而选择了在200 μmol·L-1Pb(NO3)2处理的细胞中探究了Pb胁迫下胞外三磷酸腺苷水平的变化是否能影响细胞损伤、H2O2含量及H2O2清除酶的活性。实验结果显示，在无Pb离子处理下，对细胞施加30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷时，没有引起细胞损伤、H2O2含量以及CAT、POD酶活性的显著性变化。而对Pb离子处理的细胞中施加该浓度的外源三磷酸腺苷则明显缓解了Pb胁迫所引起的细胞损伤、H2O2含量的积累以及CAT活性的上升；同时，Pb胁迫所引起的POD酶活性的减弱也因外源三磷酸腺苷的加入而有所恢复(图10)。从上述的变化趋势和生理学参数的相关性分析，在Pb离子胁迫下，细胞外三磷酸腺苷的增加能够明显的降低植物细胞的氧化压力以及细胞损伤，这可能是由于胞外三磷酸腺苷能够刺激POD酶活性的上升或调动了细胞中其他减少H2O2产生的生理学机制。尽管其具体原因尚需进一步查实，但上述结果表明，胞外三磷酸腺苷水平的变化在铅离子胁迫诱导的细胞损伤和氧化压力中扮演着重要的角色。

Chivasa等[31]发现，细胞外三磷酸腺苷的增加能够有效缓解fumonisin(一种真菌毒素)引起的植物细胞活力的下降。因此，在一些生物性或是非生物性胁迫下胞外三磷酸腺苷对于植物细胞损伤或是活力的调控作用很可能具有一定的广谱性。期望胞外三磷酸腺苷这种功能将在未来更多学者的工作中得以证实。