川黄柏中盐酸小檗碱HPLC测定优化及其抑菌活性评价

刘洋, 冉聪, 游桂香, 何婧芝, 吴卫, 侯凯

(四川农业大学农学院, 成都 611130)

黄柏，为芸香科植物黄皮树(PhellodendronchineseSchneid.)的干燥树皮，最早记载于《神农本草经》[1]，其性寒，味苦，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效，主产于四川、贵州、云南等地。黄柏中含多种生物碱，主要为小檗碱、黄柏碱、木兰碱、巴马亭等。研究表明黄柏具有抑菌、消炎作用，体外抑菌试验发现其对多种革兰阳性及阴性菌具有抑制甚至杀灭作用[2]，其中对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧氏菌等有较强的抑制作用，低浓度时抑制细菌，高浓度时杀灭细菌；对流感病毒、阿米巴原虫、某些皮肤真菌也有一定抑制作用，与青霉素、链霉素等并无交叉耐药性，是一种广谱抗菌药材[3]。虽然2005年版《中国药典》在黄柏(即川黄柏)中增加了盐酸小檗碱的HPLC含量测定，提高了盐酸小檗碱含量在黄柏检测中的重要性[4]，但目前盐酸小檗碱的检测多局限于药品中的药量检测，对黄柏药材中的检测开展较少，所以检测方法更新缓慢。本研究旨在已有研究基础上，对检测方法中的流动相进行筛选，用十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate，SLS)代替十二烷磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate，SDS)，测定川黄柏结晶物中盐酸小檗碱的含量。优化的检测方法时间短，精确度优，流动相的变化，既降低了原流动相带来的不良影响，又能够使流动相的配置更加简单，而且十二烷基硫酸钠起泡能力弱于十二烷磺酸钠，降低流动相气泡对检测过程的影响；同时，筛选致病性强的耐药性菌株，通过体外抑菌试验进行抗菌能力检测，为开发新型抗耐药性细菌药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，广州亮化化工有限公司)；SB-800YDTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；BP211D电子天平(SARTORIUS)；SPX-150B型生化培养箱(上海琅玕实验设备有限公司)；SW-CJ-2FD型超净工作台(苏净安泰空气技术有限公司)。

1.2 试剂与材料

试验材料为川黄柏，收集于第四次全国中药材资源普查项目，现保存于四川农业大学药用植物系标本室。

盐酸小檗碱标准品(DST180105-028，99.21%)购于成都德思特生物技术有限公司；SLS、氯化钠、卡那霉素、液体试剂(乙腈、甲醇、磷酸、无水乙醇均为色谱纯)均购自国药集团。

1.3 供试菌种及培养基

耐药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，来源于四川农业大学动物科技学院；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，来源于中国工业微生物菌种保存中心。

培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(LB培养基)[5](牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、水1 000 mL、琼脂粉15 g)，不加入琼脂粉即为牛肉膏蛋白胨液体培养基；脱脂牛奶平板制作参照王春林等[6]并进行改良，脱脂奶粉2 g，琼脂粉1.5 g。

1.4 材料处理

粗提物提取：使用超声辅助法[7]进行提取，提取溶剂为 HCl-70%甲醇(1∶100)，料液比1∶20，超声功率250 W，超声温度50 ℃，提取时间50 min；将提取液旋转蒸发成膏状，冷冻干燥成粉末后，用蒸馏水溶解，配置成浓度为1 g·mL-1的粗提药液。配好的药液经过0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，低温保存备用[8]。

结晶制备：取川黄柏8 g，用20倍量的0.5%醋酸甲醇溶液，加热回流1 h，迅速过滤，3次重复，合并3次滤液，加入7倍量水，加热0.5 h使盐酸小檗碱溶解，浓缩药液至4倍量左右，热水洗涤过滤，放冷至室温。加入NaCl使溶液达到饱和状态，静置过夜，待析出沉淀，过滤。将沉淀用无水乙醇冲洗数次，收集沉淀，再结晶，放冷后于100 ℃干燥至恒重。抑菌试验需配置浓度为1 g·mL-1川黄柏结晶物溶液，过滤除菌后备用。

1.5 HPLC测定方法优化

1.5.1标准品溶液制备 称取盐酸小檗碱标准品5.15 mg，用乙腈溶解，定容至10 mL量瓶中，作为盐酸小檗碱标准品贮备液，浓度0.515 mg·mL-1。

一个绿裙少女从玉米地里走过来，对树上的少女喊：“乔瞧，我们该回家了。”见秀容月明满脸是水，掏出手帕，一言不发地递给他。

1.5.2供试样品溶液制备 称取结晶样品粉末0.01 g，加入30 mL乙腈，超声处理30 min，充分溶解，称定质量，放冷后重新称定质量，用乙腈补足减少的质量，震荡摇匀过滤，滤液备用。

1.5.3色谱条件设置 参考前人[9-14]研究，对色谱条件设计4个处理，A组：甲醇-乙腈-水(40∶20∶40)，检测波长为346 nm，柱温50 ℃；B组：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(30:70)，检测波长为346 nm，柱温50 ℃；C组：乙腈-0.1%磷酸二氢钾(20∶80)，检测波长为265 nm，柱温30 ℃；D组：乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50)(每100 mL加SLS 0.1 g)，检测波长为265 nm，柱温30 ℃。各流动相进样量均为10 μL，流速为1 mL·min-1，使用前需经过超声脱气处理。

1.5.4精密度、重复性、稳定性试验检测 ①精密度试验：精确吸取盐酸小檗碱标准品溶液，按照优化的色谱条件检测，进样量10 μL，重复6次，记录峰面积。

②重复性试验：称量同一样品粉末0.01 g 共6份，按照1.5.2的方法制备供试样品溶液，用优化的色谱条件测定，进样量10 μL，记录峰面积。

③稳定性试验：称量同一样品粉末0.01 g，按照1.5.2方法制备供试样品溶液，置于室温下，分别于配制后2、4、6、8、10、12、24 h按照优化过的色谱条件测定，进样量为10 μL，记录峰面积。

1.5.5加样回收率测定 称取已知含量的结晶样品0.01 g共9份，每3份为一个梯度，每个梯度分别加入浓度为0.515 mg·mL-1的标准品溶液300、600和 900 μL，加入乙腈至体积为30 mL，充分溶解，称定质量，超声处理30 min，放冷后称定质量，用乙腈补足减少质量，震荡摇匀过滤，滤液上机测定。

1.5.6样品含量测定 为了验证优化方法的适用性，对来自四川不同产地的3份川黄柏药材(收集自第四次全国中药材资源普查)，粉碎过筛，称取粉末制成川黄柏结晶(结晶1、结晶2、结晶3)，再取第一份川黄柏药作粗提处理(粗提1)；按照1.5.2方法制备供试样品溶液，利用优化的色谱条件测定，记录峰面积，以外标法计算盐酸小檗碱含量。

1.6 抑菌活性评价

1.6.1菌种活化 用划线法将供试菌种移接入相应的无菌斜面培养基，37 ℃培养，活化24 h。将活化好的细菌用适量LB液体培养基在试管中培养24 h，配制成为OD600=0.1的菌悬液，备用。

1.6.2川黄柏结晶物抑菌效果测定 吸取上述菌悬液10 μL于牛肉膏固体培养基平板上，均匀涂满平板表面。在平板中心处打孔，直径为5 mm。每孔分别注入浓度均为1 g·mL-1的川黄柏粗提液和结晶物溶液各100 μL，以水作阴性对照，同浓度卡那霉素作阳性对照。每个处理3次重复。37 ℃生化培养箱中孵育24 h。用十字交叉法测定抑菌圈直径，取平均值，参照美国CLSI抗菌药物敏感试验操作标准[15]进行判断。

1.6.3稀释法测定最小抑菌浓度(MIC) 在1.6.2中已涂菌打孔的培养皿中分别加入川黄柏结晶物溶液(1 mg·mL-1)及稀释后浓度为0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg·mL-1的药液，每个处理3次重复，以水作对照。在37 ℃恒温培养箱中孵育24 h。用十字交叉法测定抑菌圈直径。

1.7 数据处理与分析

试验数据处理和作图采用Microsoft Excel 2010进行，运用SPSS 20.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同色谱条件的盐酸小檗碱检测

不同色谱条件的盐酸小檗碱检测结果(图1)显示，A、B、C三组色谱条件的检测结果不佳，得到的色谱峰数量和出峰顺序不同，A、B组样品分离度差，峰值低，B、C组出现前延和拖尾现象，峰形不对称，这3组检测方法对标准品和待测样品的重现度差，因此无法继续优化。D组色谱条件中，将流动相中的SDS用SLS代替，265 nm作为盐酸小檗碱的检测波长。结果发现，无论是标准品或者待测样品的色谱图，均没有出现干扰峰，峰形对称，无异形峰出现，且水平基线平稳，无噪音，分离到的峰形对称，分离度佳，可以作为一种新的测定盐酸小檗碱的色谱方法。

注：A: A组；B: B组；C: C组；D: D组。蓝色实线为标准品色谱图，红色实线为结晶样色谱图。

2.2 优化检测方法的线性关系考察

为了对盐酸小檗碱优化检测条件进行验证，分别吸取配制好的盐酸小檗碱标准品溶液2、4、6、8、10 μL，按照优化的色谱条件上机检测，记录峰面积。对盐酸小檗碱含量(x)和对应峰面积(y)进行线性回归分析，求得盐酸小檗碱的回归方程y=2×106x+92.542，R2=0.999 7，线性范围为103～515 mg·L-1。表明在这个范围内浓度与面积成正比，分析结果准确。

2.3 精密度、重复性、稳定性试验

优化色谱条件的精密度、重复性、稳定性试验结果见表1，精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差(RSD)分别为0.49%、1.23%、0.29%，表明3个指标的试验结果的准确度均较好，供试样品溶液在24 h之内性质稳定。

表1 精密度、重复性、稳定性试验结果

2.4 加样回收率测定

按照优化的色谱条件测定并分析，计算加样回收率，结果见表2，可见回收率均在96%以上，说明该检测方法检测灵敏度高，准确度好。

表2 加样回收试验结果

2.5 样品含量测定

为了进一步验证优化检测方法的效果，对不同产地的川黄柏药材进行检测，结晶处理的检测结果(表3)表明，该优化方法适用于不同品种的测定，而且在粗提物(未结晶处理)的检测过程中，发现检测方法能够有效检测盐酸小檗碱的含量，没有干扰峰或者其他物质的影响，说明方法专属性极好，高效快捷，再次佐证了优化方法准确有效。

表3 川黄柏结晶的检测结果

2.6 抑菌活性评价

川黄柏对耐药性金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌作用结果如表4。可见川黄柏粗提物和结晶对两种菌株都有一定程度的抑制作用，同浓度下结晶物的抑制效果优于粗提物。与阳性对照卡那霉素相比，川黄柏对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于抗生素，对铜绿假单胞菌的抑菌效果与抗生素类似。

表4 川黄柏粗提物和结晶的抑菌效果比较

稀释法测定最小抑菌浓度结果(图2)表明，随着浓度的降低，耐药性金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌两种细菌的抑菌圈均显著缩小，抑菌效果降低，但对金黄色葡萄球菌的抑制效果比对铜绿假单胞菌的抑菌效果更强。试验过程中发现，筛选到的两株细菌，会形成生物膜，增强细菌耐药性和抗逆性，会使卡那霉素对细菌无法起到杀灭作用，而川黄柏依旧有抑菌效果，说明川黄柏能够破坏生物膜后渗透进入生物膜内部，从而起到杀灭抑制作用，这也可能是川黄柏对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于抗生素(表4)的原因；川黄柏结晶溶液对两种细菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为：耐药性金黄色葡萄球菌0.2 mg·mL-1，铜绿假单胞菌<0.1 mg·mL-1。

图2 川黄柏结晶的最小抑菌浓度

3 讨论

目前，用HPLC测定盐酸小檗碱含量的方法报道较多，但主要集中在对知柏地黄浓缩丸[16]、复方黄连素片[17]这些以盐酸小檗碱为主要成分的药品中，对药材中含量测定方法的研究较少。一方面，药品的成分相对明确，含量较高，测定方法的建立相对简单，而在药材中，由于川黄柏的成分复杂，不同提取方式也会对测定结果有较大影响，测定方法的建立比较困难；另一方面，药材中含量的确定，对药材质量的把控很有必要。目前对川黄柏药材中盐酸小檗碱测定的方法，主要参考药典[4]的方法，但在实际测定中，药典所使用的SDS也有它的局限性，虽然都是阴离子表面活性剂，但SLS在生化和免疫实验中更为常用，而SDS因其制造及性能上的一些缺点，很少在医学、生物学实验室使用，是一种有毒试剂，故选用SLS作为流动相，不仅降低流动相配制的复杂性和安全性，而且SLS的起泡能力弱于SDS，使得流动相中气泡含量更少，降低对测定过程的影响。之所以选择对川黄柏先进行结晶纯化，是考虑到提取过程中的成分损失，纯化之后的川黄柏样品也能排除杂质的影响，检测过程也能减少误差，更直观地了解测定方法的效果。

本研究表明，优化后的测定方法检测到盐酸小檗碱的保留时间为15 min左右，出峰时间快，比李红玲等[18]和潘军[9]的检测方法缩短了5～6 min，节约流动相与仪器的使用损耗，这在大批量测定盐酸小檗碱的实际应用中具有重要意义。对川黄柏药材粗提物的检测结果也表明，该检测方法不仅可以有效检测结晶物中的盐酸小檗碱，而且在川黄柏粗提物中盐酸小檗碱的检测中同样适用，没有出现干扰峰，峰形对称，无异形峰出现，且水平基线平稳，无噪音；虽峰形微宽，推测可能是流动相从柱子上洗脱目标物的效率不够，也是因为样品选用的是非结晶品导致，可以通过加大流速或提高梯度洗脱速率，提高流动相极性的变化率，以达到快速洗脱的目的。

随着抗生素使用的泛滥，越来越多的耐药性细菌产生，对细菌疾病的治疗再度陷入困难，因此寻找新的抗菌药物是刻不容缓的[19]。临床研究中，黄柏具有良好的抗感染作用[20-22]，但对耐药性菌株的抑制效果目前研究较少，本研究通过粗提和结晶纯化后的川黄柏提取物，对强致病性的耐药性金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行体外抑菌试验发现，可以观察到明显的抑菌圈，说明粗提和结晶的川黄柏提取物能够抑制耐药性细菌的生长，且对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑菌效果，抑菌效果甚至优于抗生素的抑菌能力，这表明川黄柏提取液拥有很好地抑菌活性和抑菌广谱性。本研究结果中，结晶提取物的抑菌能力远远高于刘萍等[23]和谢梅等[20]研究的川黄柏粗提物抑菌能力，结果表明川黄柏盐酸小檗碱的抑菌能力非常强，同时结晶化处理也能够更好的发挥川黄柏的抑菌作用。盛美萍等[24]研究表明，盐酸小檗碱纯品可引起溶血性贫血以致黄疸，静脉注射或滴注也会引起血管扩张、血压下降、心脏抑制等反应，严重时发生阿斯综合征，甚至死亡，目前中国已宣布淘汰盐酸小檗碱的各种注射剂，说明单独使用或者过量使用盐酸小檗碱单体化合物治疗细菌疾病时具有极大的安全隐患。而川黄柏作为传统中药，通常与其他药材配伍使用，历史证明了它的安全性和可靠性。笔者使用川黄柏药材进行试验，既能确保其抑菌效果，又能降低临床使用风险，其优良的抑菌效果再次证明川黄柏在抗感染方面具有很高的开发价值及临床应用前景。

综上所述，本研究方法具有高效、专属性强、流动相配制简单、安全的优势，可有效地评价川黄柏药材中盐酸小檗碱的含量；体外抑菌试验为川黄柏抑菌效果提供理论基础，为新型抑菌剂提供了又一新的潜在材料。