拟南芥SWEET1/2/3基因突变体构建及功能鉴定

辛红佳, 李鹏程, 滕守振, 李圣彦, 汪海, 郎志宏

(中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081)

植物SWEET蛋白通过细胞内和细胞间的糖运输来参与植物的不同生理过程，包括源库糖运输、花蜜分泌、种子发育、病原体营养、植物衰老和光合作用等[1-7]。SWEET蛋白由7个跨膜α-螺旋组成，其中，3个相邻跨膜α-螺旋组成一个TM(transmembrane domain)，即SWEET蛋白由两个TMs和跨膜螺旋组成，其结构类似于3-1-3形式，位于中间的α-螺旋主要起连接两个TMs的作用[8]。基于断裂泛素重组(split-ubiquitin)的酵母双杂交分析表明，7-TM SWEETs需要寡聚化来形成足够大的孔满足蔗糖分子通过，这表明同源二聚化对于SWEETs的功能是必需的[9]。

在拟南芥中有17个SWEET基因，通过系统发育分析将这些成员分为四个进化枝(Clade)[10]，其中SWEET1～SWEET3属于进化枝Ⅰ(CladeⅠ)，SWEET4～SWEET8属于进化枝Ⅱ(Clade Ⅱ)，SWEET9～SWEET15属于进化枝Ⅲ(Clade Ⅲ)，SWEET16～SWEET17属于进化枝Ⅳ(Clade Ⅳ)。尽管每个进化枝的成员都具有相似的底物偏好，例如，进化枝Ⅰ和Ⅱ的成员更偏好己糖，而进化枝Ⅲ SWEET蛋白在运输蔗糖中起着重要作用，但是，一个进化枝中的SWEET通常具有不同的生物学功能。拟南芥SWEET1是一种对pH不敏感的葡萄糖单向转运蛋白，定位于质膜上，并在花中高表达，其可能为配子体、蜜腺或生长中的花粉管提供营养[11-12]。SWEET2转运葡萄糖通过液泡膜，并在拟南芥根中高表达，它可以限制根中的碳固定和阻止病原菌的侵染[10]。目前尚不清楚SWEET3的生理功能。

在拟南芥中，通常使用T-DNA插入突变体对SWEET基因进行遗传分析，这种方式有时无法产生真正意义上的基因敲除突变体。为了解决这个问题，本研究通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，分别获得了sweet1、sweet1/2、sweet3、sweet1/2/3敲除突变体。通过表型观察发现，各种突变体的角果长度明显短于野生型(wild type, WT)，但突变体之间的差异并不明显，表明SWEET1/2/3之间存在遗传/生化相互作用。并且，这些突变体对6%的葡萄糖敏感，但对果糖不敏感。进一步研究发现，参与葡萄糖信号通路的重要基因HXK1、KIN10和KIN11的表达水平在不同的突变体和野生型中没有明显的变化。实验分析表明，SWEET1/2/3对果实的形成起重要的作用，利用基因编辑技术研究家族基因功能是一种有效的手段。

1 材料和方法

1.1 植物材料和生长条件

使用拟南芥哥伦比亚生态型Col-0(由本实验室保存)创建突变体，生长环境为22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照强度12 000 lx，空气湿度40%～60%。拟南芥hxk1突变体购自ABRC(https://abrc.osu.edu/)拟南芥种质资源库。

1.2 不同物种SWEET基因的系统发生分析

所有SWEET蛋白序列均从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)或UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)下载。Clustal W使用默认参数进行多序列比对[13]。系统发育分析使用MEGA 7.0软件，采用邻接法，bootstrap设定为1 000。使用Vector NTI advance 11.5软件计算氨基酸序列相似性。

1.3 拟南芥SWEET基因家族CladeⅠ基因表达分析

从拟南芥eFP浏览器(http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi)下载了SWEET1(At1g21460)、SWEET2(At3g14770)、SWEET3(At5g53190)、HXK1(At4g29130)、KIN10(At3g01090)、KIN11(At3g29160)的表达数据[14]，使用R(3.5.1版)软件包的heatmap绘制热图。

1.4 质粒构建

参照Shan等[15]方法，利用CRISPR/Cas9系统构建用于敲除SWEET1、SWEET2、SWEET3基因的质粒载体：ATCRI A和ATCRI B分别靶向SWEET1第3外显子和第4外显子保守区内的一个位点，ATCRI C靶向SWEET1的第3个外显子和SWEET2的第1个外显子，ATCRI D靶向SWEET1第4个外显子和SWEET3第4个外显子。使用聚合酶链反应(PCR)克隆AtU6启动子和gRNA，通过重叠PCR(overlap PCR)的方法将它们融合在一起[16]，载体构建所用引物见表1。

表1 用于构建拟南芥转化载体的引物

1.5 农杆菌介导的拟南芥转化

采用浸花法侵染拟南芥，以获得转基因植物。在此步骤之前，将ATCRI A、ATCRI B、ATCRI C和ATCRI D分别转化到根癌农杆菌GV3101中。拟南芥抽薹后准备侵染，根癌农杆菌生长过夜至OD6001.0～2.0，8 000 r·min-1离心8 min，将沉淀重悬于侵染培养基(1×MS盐、5%蔗糖、pH 5.7、1 mol·L-1KOH)至OD6000.5左右，添加200 μL·L-1Silwet L-77(GE 公司，美国)，充分混合。然后将花浸泡在上述溶液中10 min，避光处理12 h，4周后收获种子。

1.6 突变体的鉴定

当转化幼苗开始长出第一对真叶时，通过喷洒0.1% Basta进行筛选，阳性植株可以正常生长，这样就得到了T0代植物。通常CRISPR/Cas9系统可以诱导靶序列中产生小片段的插入或缺失突变。采用PCR检测和测序鉴定CRISPR诱导的T1代植物的突变情况。通过CTAB方法提取拟南芥的叶片基因组DNA，并使用基因分型引物ABCD-SW1-LF/LR、C-SW2-LFnew/LR和D-SW3-LF/LR(表2)扩增包含sgRNA靶标序列，PCR反应条件为94 ℃ 20 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。对扩增片段进行测序并与Col-0序列比对，选择符合要求的突变体。

表2 用于鉴定突变体的引物

将sweet1/2与sweet3杂交得到sweet1/2/3，即获得三个位点的突变体，靶向SWEET1第3外显子，SWEET2第1个外显子和SWEET3第4外显子。通过PCR扩增和测序选择纯合的sweet1/2/3突变体。

1.7 拟南芥突变体角果长度测定实验

在种植之前，将T3代种子浸入水中，并在4 ℃下春化3 d。拟南芥生长2个月后，取23～28 cm高度的拟南芥角果并拍照，然后使用Image J测量拟南芥突变体和野生型角果的长度，使用SAS统计分析系统(第9.2版)进行差异分析。

1.8 转基因拟南芥在不同糖浓度平板上生长实验

由于SWEET为糖转运蛋白，所以在葡萄糖和果糖浓度分别为5%、6%、7%，蔗糖浓度为3%的1/2 MS固体培养基上培养Col-0、sweet1、sweet1/2、sweet3和sweet1/2/3，以鉴定高浓度的糖是否对突变体的生长产生影响。将种子种植于上述平板，4 ℃下春化3 d，垂直放置于培养架上培养。

1.9 突变体中不同糖转运相关基因表达分析

拟南芥在土壤中生长30 d，或在3%蔗糖和6%葡萄糖培养基中生长20 d，分别收取叶片或幼苗保存于-80 ℃。KIN10、KIN11、HXK1基因表达分析设计三个生物学重复，每个重复包括20个小植株，TRIzol方法提取总RNA(Transgen Code#ET111-01)，用无RNase的DNase处理RNA，然后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美国)进行逆转录，使用ABI PRISM 7500仪器(Applied Biosystems)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，Q711-02)进行实时定量PCR。反应体积为20 μL，其中含10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.8 μL 10 mmol·L-1引物，6.2 μL dH2O和3 μL cDNA模板(RT反应的10：1稀释液)。使用2-ΔΔCt[17]方法计算了三个生物学重复中的基因表达水平。

1.10 拟南芥叶片总蛋白提取和蛋白质印迹

将500 mg拟南芥组织在液氮中研磨成粉末，转移至离心管中，加入500 μL SDS蛋白提取液，涡旋并在95 ℃混合5 min，离心取上清液。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上进行免疫分析。HXK1、KIN10和KIN11抗体购自PhytoAB(USA)，抗体使用比例为1∶2 000，使用辣根过氧化物酶标记的二抗(PhytoAB，USA)以及eECL-A和eECL-B显色底物(购自康为试剂)观察目的蛋白。

2 结果与分析

2.1 不同植物SWEET基因家族系统发育分析和基因表达分析

为了探究SWEET基因家族在植物中的进化关系，从UniProt(http://www.uniprot.org/)下载了拟南芥、水稻、玉米和衣藻的蛋白序列进行多序列比对，构建系统发育树，SWEET基因家族分为五个进化枝(图1)。在拟南芥中，SWEET的CladeⅠ子家族包含三个成员：SWEET1、SWEET2和SWEET3。

注：各物种的基因用不同颜色表示，拟南芥(红色)、水稻(绿色)、玉米(黑色)、衣藻(紫色)，17个AtSWEET分为4个进化枝(Clade)，拟南芥只有SWEET1/2/3属于Clade Ⅰ。

为了分析SWEET1、SWEET2和SWEET3的表达模式，从拟南芥eFP网站(http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi)下载了三个基因的表达数据[14]，使用R(3.5.1版)程序包绘制热图。将葡萄糖信号通路中的关键基因KIN10、KIN11和HXK1的表达数据进行了下载和同步分析。结果显示，SWEET1在花器官发生和发育中优先表达，SWEET2在营养和生殖器官中都有表达，而SWEET3仅在花期表达；HXK1、KIN10和KIN11基因在拟南芥的整个生长发育期均有表达，HXK1基因在花发育时期表达水平更高(图2)。

注：蓝色表示表达量低；红色表示高表量高。

2.2 转基因拟南芥的检测及获得

为了研究拟南芥SWEET基因家族CladeⅠ基因的生物学功能，利用CRISPR/Cas9系统构建了ATCRI A、ATCRI B、ATCRI C、ATCRI D四个敲除载体，如图3所示。

注：在ATCRI A和ATCRI B中设计的sgRNA序列分别靶向同源的SWEET1外显子3和外显子4保守区内的位点，ATCRI C靶向SWEET1外显子3和SWEET2外显子1，ATCRI D靶向SWEET1外显子4和SWEET3外显子4。

浸花法转化获得了转基因拟南芥，通过PCR检测和Sanger测序在靶位点检测SWEET1、SWEET2和SWEET3基因突变情况：SWEET1基因靶位点缺失了一个碱基G，使SWEET1蛋白在第69位氨基酸处翻译提前终止，导致基因功能丧失；SWEET2基因在第56位核苷酸增加一个碱基T，移码造成翻译提前终止；SWEET3基因在380位缺失一个碱基G，在390位出现了终止密码子，翻译提前终止，基因功能丧失，获得了sweet1、sweet1/2和sweet3突变体。此外，将sweet1/2与sweet3杂交并自交获得了三个位点突变的纯合突变体sweet1/2/3。

2.3 拟南芥突变体角果长度分析

将上述CRISPR/Cas9产生的敲除突变体用于进一步的表型分析。与三个SWEET基因在生殖生长阶段的优先表达相吻合，sweet1、sweet1/2和sweet3突变体在营养生长阶段没有表现出明显的表型(图4)。然而，研究发现在生殖生长阶段突变体角果的长度明显比野生型的短(图5)。SWEET1/2/3基因突变仅影响角果的长度，不影响结实和种子的繁殖力。三突变体sweet1/2/3的果实长度与单突变体或双突变体相比较短，但是没有统计学上的差异，说明SWEET1、SWEET2和SWEET3基因在相同的遗传/生化途径中起作用。这些结果表明，CladeⅠSWEET基因是角果长度的正调控因子。

图4 营养生长阶段纯合突变体的表型

注：A:角果(标尺为1 cm)；B：角果长度显著性分析。在t检验中，***、**、*分别表示P <0.001、P <0.01、P <0.05水平具有统计学意义(n=21)。

2.4 拟南芥突变体对葡萄糖敏感性分析

为了解由SWEET基因家族调控的糖信号通路，在含有3%蔗糖、6%葡萄糖和6%果糖的1/2 MS培养基上培养sweet1、sweet1/2、sweet3和sweet1/2/3纯合突变体和Col-0，一个月后生长状态如图6所示，虽然在3%蔗糖和6%果糖下未观察到表型差异，但在6%葡萄糖的培养基中，与Col-0相比，sweet1、sweet1/2和sweet1/2/3突变体幼苗的生长速率和总生物量显著降低，表现为叶小、早衰和根长较短，但sweet3突变体没有表现出更敏感。与长角型表型一致，双突变体sweet1/2和三突变体sweet1/2/3的葡萄糖敏感性表型与单突变体相似，这表明sweet1和sweet2基因在相同的遗传/生化途径中起作用，具有协同作用，但没有叠加功能。与sweet1突变体对6%葡萄糖的敏感性相比，sweet1/2和sweet1/2/3突变体没有表现出更敏感的表型，说明sweet1可能在葡萄糖信号传导中起着更重要的作用。

图6 突变体sweet1、sweet1/2、sweet3、sweet1/2/3在幼苗期表型

2.5 葡萄糖信号关键基因的表达分析

为了进一步了解突变体中糖信号调节机制，我们比较了突变体和野生型三种主要糖信号通路基因己糖激酶1基因HXK1、葡萄糖传感器和葡萄糖能量传感器激酶基因KIN10和KIN11的表达水平。在补充有3%蔗糖的1/2 MS培养基上，HXK1、KIN10、KIN11基因的转录表达水平在所有突变体和WT植物之间没有显著差异(图7)。与野生型相比，仅在6%葡萄糖培养基上，sweet1/2和sweet3突变体的HXK1转录水平略低。蛋白质印迹法结果显示HXK1、KIN10、KIN11基因在突变体和野生型中正常表达，尽管其表达水平略有不同(图8)，但CladeⅠSWEET基因的敲除并没有严重影响葡萄糖信号通路中的基因的表达。因此，作为糖转运蛋白，CladeⅠSWEET基因有助于糖的装载和转运，但对葡萄糖信号基因没有调节作用。

注：在t检验中，***、**、*分别表示P<0.001、P<0.01、P<0.05水平具有统计学意义(n=21)。

图8 不同突变体中HXK1、KIN10和KIN11蛋白Western分析

3 讨论

拟南芥SWEET1/2/3基因的研究较多，但生物学功能尚不明确，CRISPR/Cas9技术可以打破以往由于T-DNA插入UTR或内含子区域而无法产生真正意义上的功能丧失突变体的限制，利用多基因突变体研究基因功能。本研究构建了四个载体，分别为ATCRI A、ATCRI B、ATCRI C和ATCRI D，载体中的5′-NGG PAM(protospacer adjacent motif)之前是20 nt的引导序列，这对于CRISPR/Cas9系统与靶DNA的结合特别重要，脱靶将影响敲除效率。BLAST搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)可确保5′-N(20)-NGG-3′或5′-CCN-N(20)-3′是唯一的。四个载体同时转化农杆菌，但是没有获得由ATCRI B和ATCRI D 载体的靶向位点针对SWEET1的第4外显子的突变体，可能是染色质结构和靶区域的修饰影响了CRISPR/Cas9系统的靶向突变。最后得到了sweet1、sweet1/2、sweet3和sweet1/2/3突变体，并作进一步研究。

SWEETs已在动物、植物和细菌中得到鉴定，它们在整个生物界的糖转运中起着重要作用。本课题组克隆并鉴定了玉米CladeⅠSWEET基因，命名为CST1，该基因定位于副卫细胞膜中，并促进气孔导度和光合作用。CST1编码葡萄糖转运蛋白，cst1突变体叶片的气孔开放减少，并且具有碳饥饿和早衰的表型[5]。玉米CST1基因和拟南芥SWEET1/2/3在系统发生树上都位于CladeⅠ，但它们没有相同的生理功能和时空表达模式。sweet1、sweet1/2和sweet1/2/3突变体表现出角果长度变短，在整个生长阶段看不到叶片衰老的表型，进一步说明SWEETs基因在不同物种通过基因复制产生了新的生物学功能[5]。

糖作为碳源，为植物的生长和发育提供能量。拟南芥中有三个主要的葡萄糖信号调节因子：葡萄糖传感器己糖激酶HXK1、葡萄糖能量传感器激酶KIN10 和KIN11[18]。HXK1作为第一个葡萄糖传感器，在信号传导、调节各种基因表达和促进植物生长方面起着主要控制作用，但这些功能与其代谢功能无关[19]。Hexokinase-like 1-1(hkl1-1)突变体和葡萄糖不敏感2-1(gin2-1)突变体在6%葡萄糖中表现出不同的表型，hkl1-1和WT敏感，gin2-1不敏感，因此意味着它们参与了不同的葡萄糖信号通路[20]。在幼苗的早期发育过程中，糖信号传导与胁迫、防御激素信号传导途径相互作用，例如gin1被确定为ABA途径中aba2的等位基因，gin4是乙烯途径中ctr1的新等位基因。gin1和ctr1突变体幼苗均对高浓度葡萄糖不敏感[21]，但是突变体sweet1、sweet1/2和sweet1/2/3均对6%葡萄糖敏感，这意味着拟南芥中sweet1/2/3基因存在于不同的葡萄糖信号通路。在sweet1、sweet1/2、sweet1/2/3和野生型中，HXK1、KIN10、KIN11基因的表达相似，表明CladeⅠSWEET基因参与了与HXK1、KIN10、KIN11不同的信号通路或为其下游基因调控的葡萄糖信号转导。对于两个表型，短角果和对葡萄糖的敏感性，没有发现这三个基因的功能叠加作用。

拟南芥CladeⅠSWEET基因参与种子发育和影响角果的长度。利用CRISPR/Cas9技术创建的一系列突变体，是深入研究拟南芥CladeⅠSWEET基因的葡萄糖信号转导的生理功能和分子机制的理想材料。