不同体重指数代谢综合征患者外周血iNKT细胞的变化及与内脏脂肪指数的相关性

程运杰，王晓丽，常向云

(1 石河子大学医学院，新疆 石河子 832002；2 浙江省立同德医院内分泌科，浙江 杭州 310030； 3 石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002)

代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是一组以多种心血管代谢危险因素聚集为特征的临床症候群，是2型糖尿病和动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的易感因素[1]。目前，临床对于MS的病因、发病机制、定义以及诊断标准等尚未达成统一。学术界广泛认为MS的主要发病机制是中心性肥胖和胰岛素抵抗，但是这一观点并不能全面解释MS的所有情况。脂肪组织分为皮下脂肪和内脏脂肪，真正与MS的发生密切相关的是内脏脂肪的聚集而非皮下脂肪[2]。近年来有学者提出，MS是一种亚临床炎症状态，炎症可能是肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病以及MS各组分的重要联结点[3]。恒定自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞是一类特殊T淋巴细胞亚群，能够通过多种代谢和免疫途径调控免疫反应，参与维持脂肪组织内免疫环境稳态[4]。最新研究发现，iNKT细胞与脂肪组织炎症反应密切有关[5]。目前，国内外少见iNKT细胞与MS的关系的相关研究。本研究拟探讨MS患者外周血iNKT细胞的变化及其与内脏脂肪的关系，了解iNKT细胞在MS发病过程中的作用，以期为MS的临床干预提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

入选2016年1月—2017年12月在石河子大学医学院第一附属医院就诊的MS患者80例，其中男性43例，女性37例，年龄(35-75)岁，平均(55.2±9.3)岁。MS的诊断根据2017年中华医学会糖尿病学分会制定的代谢综合征的诊断标准，以下五项符合3项及以上即诊断[6]：(1)腹型肥胖：腰围男性≥90 cm，女性≥85 cm；(2)高血糖：空腹血糖≥6.1 mmol/L，或糖负荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L和(或)已确诊为糖尿病并治疗者。(3)高血压：血压≥130/85 mmHg及(或)已确认为高血压并治疗者。(4)空腹TG≥1.7 mmol/L。(5)空腹HDL-C<1.04 mmol/L。MS患者依据体重指数(BMI)分两组，MS-1组：BMI ≥ 25 kg/m2，共43例，其中男性21例，女性22例；MS-2组：25 kg/m2>BMI ≥ 18.5 kg/m2，共37例，其中男性22例，女性15例。另选同期在我院体检的60例健康志愿者作为对照组。排除标准：妊娠或哺乳期妇女、严重的心、肝、肾脏疾病，恶性肿瘤，甲状腺疾病(甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症)，自身免疫性疾病，服用免疫抑制剂及糖皮质激素，急性感染性疾病。三组性别构成、年龄无统计学差异，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 临床资料及生化指标检测

嘱研究对象空腹、排尿后测身高、体质量；站立位，经肋弓下缘和髂嵴上缘的连线中点绕腹一圈测腰围；经臀部最隆起部位测臀围；嘱受试者安静休息5 min，测量收缩压(SBP)、舒张压(DBP)。计算体重指数(BMI)：体重(kg)/身高(m2)。采集空腹静脉血5 mL，用全自动生化分析仪(Hitachi 7180，日本)检测空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)。电化学发光法(E170，罗氏)检测空腹胰岛素(FINS)水平。全血细胞分析仪检测外周血白细胞计数(WBC)和淋巴细胞百分比。根据空腹血糖及空腹胰岛素水平，计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素分泌指数(HOMA-β)[7]：HOMA-IR=(FINS × FBG)/22.5，胰岛素分泌指数HOMA-β=FINS ×20/(FBG -3.5)，内脏脂肪指数(visceral adiposity index，VAI)计算方法如下[8]：

1.2.2 ELISA检测血清sCD163水平

用促凝采血管采集研究对象外周静脉血3 mL，静止30 min，2000 r/min离心5 min，取上清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定(美国BIO-Rad检测仪)血清sCD163水平(试剂盒购自联科生物技术有限公司)。

1.2.3 流式细胞术检测iNKT细胞频率

用EDTA抗凝管采集研究对象外周静脉血5 mL，加入等体积的磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加于Ficoll-Paque淋巴细胞分离液液面上，室温下2000 r/min转速离心25 min，不同细胞分层为(从上到下)：血浆层、灰白色淋巴细胞层、透明分离液层和红细胞粒细胞层，用吸管小心吸取灰白色淋巴细胞层，移入另一试管中，加入10 mL磷酸盐缓冲液，1000 r/min离心10 min，洗涤2次，弃上清，加入50 μL染色缓冲液重悬细胞，获得外周血淋巴细胞(PBMC)，加入CD3-PerCP抗体和Vα24-Jα18-FITC抗体(eBioscience,San Diego,USA)，4 ℃避光孵育20 min，加入磷酸盐缓冲液洗涤1次，加入流式缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪 (Partec,Nuremberg,Germany) 检测，CD3和 Vα24-Jα18双阳性区即为iNKT细胞。

1.2.4 流式细胞术检测胞内因子

将PBMC接种于96孔板，加入PMA(1∶100)和ION(1∶20)于5%的CO2培养箱培养1.5 h激活细胞，加入BFA(1∶10)继续培养3.5 h，将细胞转入流式管，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞1次，1000 r/min离心10 min，以50 μL染色缓冲液重悬细胞，加入CD3-PerCP抗体和Vα24-Jα18-FITC抗体对细胞表面染色，4 ℃避光孵育20 min，加入磷酸盐缓冲液洗涤1次，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入PFA固定20 min，加入破膜剂1 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入染色缓冲液50 μL重悬细胞，加入IL-4-APC抗体和IFN-γ-PE抗体，4 ℃避光孵育20 min，加入磷酸盐缓冲液洗涤1次，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入流式缓冲液重悬细胞，上机检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床资料比较

各组性别、年龄无统计学差异(P>0.05)；总MS组BMI、WC、SBP、DBP均高于对照组(P<0.05)；MS-1组BMI、WC、SBP、DBP高于MS-2组和对照组(P<0.05)，MS-2组SBP高于对照组(P<0.05)，(表1)。

分组例数男/女年龄/岁BMI/(kg·m-2)WC/cmSBP/mmHgDBP/mmHg总MS组8043/3755.2±9.226.3±3.693.3±11.2132±1181±8MS-1组4321/2254.2±8.728.7±3.499.9±10.5135±1282±9MS-2组3722/1556.2±9.923.5±1.2#86.1±5.6#130±9#80±7#对照组6032/2852.7±9.523.6±2.2∗#84.3±5.7∗# 125±7∗#￥76±7∗#

注：与总MS组比较，*P<0.05；与MS-1组比较，#P<0.05；与MS-2组比较，￥P<0.05

2.2 各组生化指标比较

总MS组、MS-1组、MS-2组TG、TC、FBG、FINS均高于对照组(P<0.05)；总MS组、MS-1组LDL-C高于对照组(P<0.05)；MS-1组TG、FBG、FINS高于MS-2组(P<0.05)；总MS组、MS-1组、MS-2组HDL-C均低于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 各组生化指标比较

分组TG/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)FBG/(mmol·L-1)FINS/(pmol·L-1)总MS组2.0±0.85.4±1.33.1±1.01.0±0.38.0±2.89.0 (6.9,11.8)MS-1组2.3±0.95.5±1.23.3±0.90.9±0.28.5±2.99.4 (8.1,13.7)MS-2组1.5±0.4#5.2±1.53.0±1.01.1±0.37.3±2.5#8.3 (6.6,10.3)#对照组1.1±0.3∗#￥4.6±0.8∗#￥2.7±0.6∗#1.4±0.3∗#￥5.3±0.9∗￥6.3 (5.3,8.4)∗#￥

注：与总MS组比较，*P<0.05；与MS-1组比较，#P<0.05；与MS-2组比较，￥P<0.05

2.3 各组sCD163、HOMA-IR、HOMA-β及VAI的比较

总MS组、MS-1组、MS-2组血清sCD163水平、HOMA-IR、HOMA-β、VAI值均高于对照组(P<0.05)；MS-1组血清sCD163水平、HOMA-IR、VAI值均高于MS-2组(P<0.05)；而MS-1组HOMA-β与MS-2组比较，无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 各组sCD163、HOMA-IR、HOMA-β及VAI的比较

分组sCD163/(ng·mL-1)HOMA-IRHOMA-βVAI总MS组260.2±56.93.3±1.466.8±53.53.4±1.8MS-1组308.4±23.83.8±1.563.3±44.14.2±1.8MS-2组202.3±21.2#2.7±1.1#70.8 ±63.12.3±0.9#对照组134.7±52.7∗#￥1.6±0.6∗#￥97.9±59.3∗#￥1.3±0.6∗#￥

注：与总MS组比较，*P<0.05；与MS-1组比较，#P<0.05；与MS-2组比较，￥P<0.05

2.4 各组外周血iNKT细胞频率及其分泌功能的比较

总MS组、MS-1组、MS-2组及对照组外周血WBC计数均无统计学差异(P>0.05),具有可比性。各组外周血WBC计数、淋巴细胞比例无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。MS-1组iNKT细胞频率在0.01%～0.78%之间，MS-2组iNKT细胞频率在0.06%～0.91%之间，对照组iNKT细胞频率在0.11%-1.05%之间。各MS组iNKT细胞频率均低于对照组(P<0.05)，MS-1组低于MS-2组(P<0.05)；各MS组IFN-γ+iNKT比例均高于对照组(P<0.05)，MS-1组高于MS-2组(P<0.05)；各MS组IL-4+iNKT比例均低于对照组(P<0.05)，MS-1组低于MS-2组(P<0.05)；IFN-γ+iNKT/IL-4+iNKT比值比较，各MS组均高于对照组(P<0.05)，MS-1组和MS-2组比较无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表4 各组外周血iNKT细胞频率及其分泌功能的比较

分组iNKT细胞频率/%IFN-γ+iNKT比例/%IL-4+iNKT比例/%IFN-γ+iNKT/IL-4+iNKTWBC(×109)淋巴细胞比例/%总MS组0.38±0.2551.9±12.720.1±9.33.3±1.96.0±1.531.2±3.7MS-1组0.31±0.2255.3±11.9 18.8±8.03.5±1.85.9±1.430.7±3.6MS-2组0.45±0.28#46.7±12.5# 22.0±10.8#3.0±2.06.3±1.631.6±3.8对照组0.72±0.29∗#￥37.8±13.8∗#￥29.1±13.1∗#￥1.7±1.5∗#￥5.7±1.029.7±4.7

注：与总MS组比较，*P<0.05；与MS-1组比较，#P<0.05；与MS-2组比较，￥P<0.05

2.5 不同性别MS患者外周血iNKT细胞频率及其分泌功能的比较

男性、女性MS患者外周血iNKT细胞频率比较无统计学差异(P<0.05)。iNKT细胞分泌功能比较，两组IFN-γ+iNKT细胞、两组IL-4+iNKT细胞的比例均无统计学差异(P>0.05)。并且外周血WBC计数、淋巴细胞比例均无统计学差异(P>0.05)(表5)。

表5 不同性别MS患者外周血iNKT细胞频率及其分泌功能的比较

性别iNKT细胞频率/%IFN-γ+iNKT比例/%IL-4+iNKT比例/%WBC(×109)淋巴细胞比例/% 男性0.31±0.2053.4±12.7 20.6±9.26.1±1.731.1±3.8 女性0.28±0.21 53.0±11.4 19.1±9.8 5.9±1.230.2±3.6

2.6 外周血iNKT细胞频率及分泌功能的相关性分析

为分析外周血iNKT细胞频率及分泌功能与各个临床生化指标的相关性，我们分别以iNKT细胞频率、IFN-γ+iNKT细胞比例、IL-4+iNKT细胞比例为因变量，以WC、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、sCD163、VAI为自变量进行相关分析，结果显示，iNKT细胞频率与WC、BMI、TG、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163、VAI呈负相关关系(P<0.05)，与HDL-C呈正相关关系(P<0.05)；IFN-γ+iNKT细胞比例与WC、BMI、TG、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163、VAI呈正相关关系(P<0.05)，与HDL-C、HOMA-β呈负相关关系(P<0.05)；IL-4+iNKT细胞比例与WC、BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163呈负相关关系(P<0.05)(表6)。

表6 外周血iNKT细胞频率及分泌功能与临床生化指标的相关性分析

2.7 MS危险因素的Logistic 回归分析

用条件前进法构建MS危险因素的logistic回归模型，将iNKT细胞频率、IFN-γ+iNKT 比例、IL-4+iNKT比例、sCD163、HOMA-IR、HOMA-β、VAI作为协变量纳入模型，因WC、BMI、TG、HDL-C、FBG、FINS与HOMA-IR、HOMA-β、VAI存在共线性关系，故未纳入分析。结果显示，iNKT细胞频率、HOMA-IR、VAI进入回归方程(P<0.05)(表7)。

表7 MS危险因素的logistic回归分析

3 讨论

MS也被称之为X综合征是多个代谢异常在个体聚集的现象，大大增加心血管疾病、糖尿病的风险[9]。目前MS的发病正在呈现年轻化趋势，而MS确切机制尚未完全清楚。最新的观点认为，MS与其下游的ASCVD、糖尿病一样都是炎症性疾病[1-2]。

肥胖与MS的发病过程的密切相关。脂肪组织按照其分布不同，可分为内脏脂肪和皮下脂肪。目前临床上评价肥胖的常用参数如：腰围、腰臀比、BMI等在评估脂肪的分布和含量方面存在一定的局限性。VAI是评估内脏脂肪的新型工具，其计算综合了腰围、体重指数、TG、HDL-C等体脂和代谢因素，且兼顾了性别差异，与磁共振检查计算的内脏脂肪含量吻合度高，能够准确反映内脏脂肪蓄积情况[10]。已有研究证实，内脏脂肪细胞膜上肾上腺受体表达较高，胰岛素受体底物蛋白-1的表达下降，使得游离脂肪酸升高，干扰胰岛素信号通路，激活组织炎症反应，最终导致胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱，而皮下脂肪没有这种作用[11]。因此，内脏脂肪过度蓄积是启动MS的重要原因。本研究中，正常体重和超重/肥胖的MS患者均表现为VAI升高，提示内脏脂肪蓄积是MS患者的重要特征；而超重/肥胖的MS患者VAI升高更加明显，其代谢紊乱、胰岛素抵抗也更严重。临床上大约20%的正常体重人群存在代谢紊乱，称之为“正常体重代谢性肥胖(metabolically obese but normal weight，MONW)”，其发生与内脏脂肪蓄积有关。

iNKT细胞是一类特殊的T淋巴细胞亚群，它既表达自然杀伤细胞的表面标志，又表达T细胞受体。iNKT细胞可识别由非多态性MHC-I类抗原呈递分子CD1d呈递的脂质分子[12]。激活的iNKT细胞的能够快速分泌多种细胞因子，包括抗炎因子(如IL-4、IL-10)和促炎因子(如IFN-γ)，发挥免疫调节作用[5]。iNKT细胞占人外周血淋巴细胞的1%左右[4]，使用不同的抗体检测结果略有差异。本研究使用CD3和Vα24-Jα18抗体标记外周血iNKT细胞，测得其频率范围在0.01%～1.05%之间，与文献报道基本一致。

机体的免疫系统和代谢系统之间存在“对话”，两者在功能上相互依赖，保持内环境的稳态，当两者的平衡被打破时，即导致“免疫代谢紊乱(immunometabolic disorders)”。Huh等[13]研究证实，生理状态下，脂肪细胞能够直接激活iNKT细胞，后者通过促进IL-4等细胞因子分泌调节脂肪组织内免疫稳态。Lynch等[14]研究显示，高脂喂养iNKT细胞缺失的小鼠，更容易诱导肥胖、脂肪肝、胰岛素抵抗和高血糖等代谢紊乱；给肥胖小鼠输注iNKT细胞，能够减轻体重、改善糖脂代谢、增加胰岛素敏感性。本研究中，MS患者外周血iNKT 细胞频率明显下降，IFN-γ+iNKT细胞比例升高，IL-4+iNKT细胞比例下降，且iNKT细胞频率与TG、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163、VAI等代谢因素呈负相关关系，提示MS患者不仅iNKT细胞数目减少，而且其功能也发生了改变，导致机体的免疫代谢稳态被打破，可能是诱发MS的重要原因。

动物研究证实，瘦的个体，iNKT细胞分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，维持脂肪组织代谢状态的稳定；肥胖过程中，iNKT细胞比例下降，脂肪组织内的巨噬细胞活化，促炎因子如IFN-γ、TNF-α释放，诱发局部慢性炎症反应及胰岛素抵抗的发生[5]。sCD163是反映巨噬细胞活化的特异性标志[15]。本研究iNKT细胞频率与sCD163、HOMA-IR呈负相关，提示MS患者iNKT细胞的下降导致了脂肪组织内巨噬细胞的活化，触发炎症反应。各种炎症因子的释放可干扰胰岛素信号通路，造成胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱的发生发展。Logistic回归分析进一步证实，iNKT细胞是MS的保护性因素(OR=0.055)，而内脏脂肪的增加和胰岛素抵抗是MS的致病因素，提示MS是免疫代谢紊乱共同作用的结果。

综上所述，本研究证实MS患者表现为不同程度的内脏脂肪蓄积，MS患者 iNKT细胞频率下降，功能发生改变，与内脏脂肪指数密切相关。人体的免疫和代谢两大系统相互制约、相互影响，很难说清孰因孰果，其中的具体机制还需要开展大量的基础和临床研究进行探索。