小白菊内酯对Kaposi肉瘤相关疱疹病毒感染细胞的影响

李英，李洁康，唐慧，张晓艳，马凌波，徐慧玲，李冬妹*

(1 石河子大学医学院生物化学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832002； 2 石河子大学科研处，新疆 石河子 832002；3 石河子市妇幼保健院，新疆 石河子 832000； 4 兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 73000)

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒，又名人类8型疱疹病毒(human herpesivirus-8，HHV-8)[1]。该病毒引发的卡波氏肉瘤(kaposi’s sarcoma,KS)是艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)最常并发的肿瘤和死亡原因之一。KSHV 能引发原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心 Castleman’s 病(multicentric castleman’s disease,MCD)[2]，还与多发性骨髓瘤，血管肉瘤，恶性皮肤肿瘤和鳞状细胞癌有关[3]。

在我国，新疆是KSHV的高感染区，由KSHV感染引发的经典型卡波氏肉瘤主要见于新疆的维吾尔族人和哈萨克族人[4]。同时，新疆也是艾滋病的高发区，因此由KSHV感染引起的疾病在新疆的发病风险更高。

本研究前期检测了新疆地区卡波氏肉瘤患者和正常人的KSHV感染率，并通过抑制性差减杂交和Affymetrix 表达谱芯片比较了4对KSHV感染的卡波氏肉瘤组织与正常皮肤组织差异表达基因[5]，依据基因差异表达谱和Connectivity Map Database数据库提供的信息，利用生物信息学方法，由北京大学医学部生物信息学系协助预测了可能逆转病毒持续感染的药物，其中小白菊内酯(parthnolide,PTL)是显著性较高的药物。小白菊内酯是医用草本植物小白菊的主要活性成分，为倍半萜内酯类化合物。小白菊内酯具有抗炎、抗病毒等多种药理作用[6]，近年来大量的体外实验研究发现小白菊内酯具有明显的抗肿瘤作用[7]。本研究尝试利用KSHV感染细胞系研究小白菊内酯对KSHV感染细胞是否具有抑制作用。此研究将为开发抗KSHV感染药物，抑制KSHV致病性和治疗相关疾病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小白菊内酯购于Sigma公司，高糖DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清、胰酶、嘌呤霉素、G418购于GIBCO公司，潮霉素购于Invitrogen 公司，CCK-8购于Biosharp公司，1%结晶紫购于Solarbio公司，兔抗人Cyclin D1购于Bioworld Technology公司，鼠抗人Bcl-2购于博奥森公司，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购于zsbio公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SK-RG细胞(KSHV感染的神经母细胞瘤细胞)培养于含 10% 的胎牛血清、6 μg/mL 嘌呤霉素的高糖 DMEM 培养基中培养，islk.219细胞(KSHV感染的内皮来源的细胞)采用含 10% 的胎牛血清、6 μg /mL 嘌呤霉素、100 μg /mL G418 和100 μg/mL潮霉素的高糖DMEM培养基培养，BCBL-1细胞(KSHV感染的淋巴瘤细胞)在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中培养，这3种细胞在37 ℃，5% CO2条件下培养。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖情况

取对数生长期细胞，以 8×103个/孔种植于96孔板中。在37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，加入相应浓度的小白菊内酯，每个浓度设 4 个复孔。继续培养24 h后，加入CCK-8试剂37 ℃ 孵育4 h，酶标仪上检测450 nm 处光密度(optical density，OD)值。实验重复 3 次，用软件 GraphPad Prism 5.01 计算 IC50。据IC50，进行实验分组并重复此实验，分别检测不同浓度的小白菊内酯处理细胞24 h，48 h后的OD值。

1.2.3 实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期的细胞，以400个/100 mm2皿的密度接种于培养皿中，37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，处理组加入不同浓度的小白菊内酯，对照组加入等体积的生理盐水。后在37 ℃，5% CO2条件下继续培养至细胞集落形成，终止培养。PBS清洗3次，4%多聚甲醛进行4 ℃ 固定20 min，用1%的结晶紫染料染30 min，双蒸水洗去染液，室温自然干燥后，计数(≥50个细胞为一个克隆)，实验重复3次。

1.2.4 Western Blot检测蛋白表达水平

将islk.219细胞以1×105个/mL的密度接种于六孔板中，37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，加入相应浓度的小白菊内酯处理24 h后，吸弃培养基，用PBS洗涤2 次，加入适量的RIPA裂解液(使用前以1∶100的比例加入PMSF)，冰上裂解30 min，然后4 ℃，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，电泳90 min后转膜。膜用含5%脱脂奶粉的1×TBST室温封闭2 h，加入一抗(Cyclin D1 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)，4 ℃ 孵育过夜，用1×TBST洗膜3次，每次5 min。二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，用1×TBST洗膜3次，每次5 min，发光试剂显色3 min，后进行压片显影。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行统计学分析，不同浓度小白菊内酯组数据之间比较采用单因素方差分析，两个样本之间的比较采用配对样本的t检验。检验水准α=0.05，P<0.05，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8确定小白菊内酯对KSHV感染细胞的IC50

采用CCK-8的方法检测利用不同浓度的小白菊内酯处理KSHV感染细胞islk.219、SK-RG、BCBL-1 24 h后的吸光度，用软件GraphPad Prism 5绘图并计算这3种细胞的IC50。Islk.219、SK-RG、BCBL-1细胞的IC50分别为21.08 μmol/L、10.75 μmol/L、13.65 μmol/L(图1)。

图1 小白菊内酯处理KSHV感染细胞24 h后的IC50

2.2 小白菊内酯使islk.219和SK-RG细胞形态改变

不同浓度的小白菊内酯处理islk.219和SK-RG细胞24、48 h后，采用倒置显微镜观察细胞形态(200×)，islk.219和SK-RG细胞随着小白菊内酯浓度的升高和时间的增加，细胞形态发生了明显的变化。

islk.219细胞随着时间和浓度的升高，细胞膨大、肿胀、变圆、脱落，而SK-RG细胞变圆，细胞质突起减少甚至消失，并且明显可以看见脱落的细胞(图2)。

图2 小白菊内酯处理KSHV感染细胞后形态改变情况(200×)

2.3 小白菊内酯抑制islk.219、SK-RG、BCBL-1细胞的增殖

采用CCK-8与平板克隆法，检测小白菊内酯对KSHV感染细胞增殖的影响。与未加小白菊内酯处理的对照组相比，用不同浓度小白菊内酯处理的细胞的生长情况均受到不同程度的抑制，并且随着药物浓度的增高，细胞增殖率随之降低，呈浓度依赖性(图3A、3B、3C)。与对照组相比，小白菊处理组的平板克隆数明显减少，差异具有统计学意义，P<0.05(图3D、3E、3F)。

注：图中A-C：小白菊内酯处理islk.219、SK-RG、BCBL-1细胞24、48 h后的OD值；D-F：平板克隆结果，与对照组相比，P<0.01图3 小白菊内酯对KSHV感染细胞增殖的影响

2.4 小白菊内酯降低islk.219细胞Bcl-2、Cyclin D1蛋白的表达水平

采用Western Blot 检测小白菊内酯对KSHV感染细胞islk.219的抗凋亡蛋白Bcl-2、和周期相关蛋白Cyclin D1蛋白表达的影响。

结果显示，与对照组相比，小白菊内酯处理组的抗凋亡蛋白Bcl-2和周期相关蛋白Cyclin D1的蛋白量表达降低，并且随着小白菊内酯浓度升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和周期相关蛋白Cyclin D1的蛋白表达越来越低，具有浓度依赖性(图4)。

图4 小白菊内酯对KSHV感染细胞Bcl-2、Cyclin D1蛋白表达的影响

3 讨论

目前，抗KSHV感染的药物主要为抗病毒药物，如阿昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦等，其通过竞争性抑制疱疹病毒的DNA聚合酶从而抑制病毒的复制[8]。KSHV编码的vMIP-I、vMIP-II 和vMIP-III蛋白具有促进血管生成的作用[9]。因此，临床上也用抗血管生成药物来治疗KS。例如：伊马替尼、索拉非尼、阿瓦斯汀等[10]。尽管抗病毒药物和抗血管生成药物在一定程度上能缓解相关疾病的病症。但是，这些疗法并不完善，具有一定的不良反应。阿昔洛韦会引起头晕、呕吐、静脉炎、皮肤瘙痒，高剂量的静脉注射可能会引发神经系统障碍，大剂量的突击注射可能会发生急性肾小管坏死。长期服用索拉非尼会有心脏缺血、高血压、胃肠道穿孔的危险。因此，开发新的抗KSHV感染的药物具有重要的意义。

近年来大量的实验表明，小白菊内酯对多种癌症具有抗肿瘤作用，如对白血病、鼻咽癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌、黑色素瘤等[11]。小白菊内酯还具有诱导一些寄生虫死亡[12]，增强化疗药物和放疗对肿瘤细胞杀伤的作用，并且其毒副反应微弱。我们在前期的实验中，也提示小白菊内酯对于KSHV病毒的致病性可能有作用。然而，小白菊内酯能否作为抗KSHV感染的药物，还有待于研究，因此开展了本项研究。

KSHV感染的细胞主要以内皮细胞和淋巴细胞为主，课题组前期研究发现KSHV还可以感染神经元细胞并且能成功表达病毒基因[13]，我们采用islk.219(KSHV感染的内皮来源的细胞)、SK-RG(KSHV感染的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞)、BCBL-1(KSHV感染的淋巴瘤细胞)进行CCK-8和平板克隆实验(BCBL-1细胞是悬浮细胞，所以未进行此实验)。实验结果表明，小白菊内酯能抑制KSHV感染细胞的增殖，尤其是在平板克隆实验中，与对照组相比，小白菊内酯处理组细胞的克隆数显著减少(P<0.01)。

为了进一步了解小白菊内酯在蛋白水平上，对增殖和凋亡的影响，我们进行了Western Blot实验。存活基因Bcl-2有抑制凋亡的作用，它所编码的蛋白质定位于线粒体内膜、核周膜和内质网上，其可通过抑制Casepase酶系和阻碍细胞色素C的释放，增强细胞对凋亡刺激因子的耐受力[14]，从而抑制细胞凋亡。Cyclin D1蛋白是一种原癌基因，它能诱导细胞从G1 期进入S 期，并具有促进基因转录的功能[15]，在促进细胞增殖中起着十分重要的作用。因此，用Western Blot实验检测了Bcl-2和Cyclin D1蛋白的表达水平，实验结果显示，小白菊内酯能使KSHV感染细胞的Bcl-2和Cyclin D1的蛋白表达水平下降,并呈浓度依赖性。

综上所述，我们得出结论小白菊内酯可以通过影响KSHV感染细胞中Bcl-2和Cyclin D1蛋白的表达，使抗凋亡蛋白和周期蛋白降低，从而诱导KSHV细胞发生凋亡，为临床进一步防治KSHV感染提供实验依据。