上调CaMK Ⅱ抑制蛋白表达对HL-60 细胞增殖的抑制作用及机制研究

朱俊锋 刘林 吴贻敏 黄志飞 何钊 邓昌曼 李宁 张凤（通讯作者）

（1 蚌埠医学院第一附属医院血液科 安徽 蚌埠 230032）

（2 蚌埠医学院临床医学系 安徽 蚌埠 230032）

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ）为钙信号下游的多功能丝/苏氨酸蛋白酶的一种，一般由α、β、γ、δ 这四种亚单位组成，可以编码十余种同功酶[1]。研究证实，CaMK Ⅱ在机体大部分的器官组织中广泛存在，在脑、骨骼肌、肝、肾、肠道等组织以及生殖系统中同样存在明显表达，神经组织中的表达水平最为显著[2]。曾有研究发现，CaMK Ⅱ异常活化与肿瘤的发生发展呈现出明显的负相关。人内源性CaMKⅡ抑制蛋白（CaMKⅡN）的来源为树突状细胞，共包含有79 个氨基酸残基[3]。在过去，针对哺乳动物的研究证实，这一抑制蛋白能够利用与已发生自身磷酸化的CaMK Ⅱ发生特异性结合，进而对CaMK Ⅱ与其磷酸化底物相结合产酸有效阻断，发挥抑制作用[4]。本文以对上调CaMK Ⅱ抑制蛋白表达对HL-60 细胞增殖的抑制作用及机制进行研究分析为目的，展开了如下研究。

1.资料与方法

1.1 一般材料

实验中所需材料包括：人急性髓系白血病(AML)细胞系HL-60（购自美国ATCC 公司）、质粒载体pcDNA3.1/myc-His(-)B（购自美国Invitrogen 公司）、脂质体 Lipofectamine2000（购自美国Invitrogen 公司）、MTT（购自美国Sigma 公司）、碘化丙锭(PI)（购自美国Sigma 公司）、BCA 蛋白检测试剂盒（购自法国PIERCE 公司）、抗人CaMK ⅡN 单克隆抗体(单抗)由本实验室合成、pcDNA3.1/CaMK ⅡN 真核表达质粒前期经本实验室合成，并通过鉴定。

1.2 实验方法

将白血病细胞系HL-60 细胞作为本次对象，而后通过Lipofectamine 2000 脂质体法对CaMK1N 基因真核表达载体pcDNA3.1/CaMK Ⅱ N 以及空载体pcDNA3.1/myc-His(-)B 进行分别转染细胞；利用Westernblot 法对转染后的HL60 细胞 CaMK ⅡN 基因表达进行检测；利用MTT 法对转染 CaMK Ⅱ N 基因的细胞增殖情况进行检测；采用半固体培养法对转基因HL-60 细胞集落形成情况进行分析；利用Hoechst33342 荧光染色，对细胞凋亡进行观察。

1.3 统计学方法

采取SPSS22.0统计学软件进行数据处理，计量资料用（）表示，采取t检验，计数资料用（%）表示，采取χ2检验，P＜0.05差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 CaMK Ⅱ N 基因转染的HL-60 细胞的目的基因表达情况统计

试验结果显示，人CaMK Ⅱ N 基因能够稳定转染HL-60 细胞。在相对分子质量11000 处，转染pcDNA3.1/CaMK ⅡN 的HL-60 细胞存在一个条带，而转染空载体pcDNA3.1 的细胞、未转染的细胞者未观察到相应条带，反映出CaMK Ⅱ N 基因稳定转入HL-60细胞内无有效表达蛋白。

2.2 上调CaMK Ⅱ N 基因表达对HL-60 细胞增殖的影响

经MTT 法检测证实，转染CaMK Ⅱ N24 小时的HL-60 细胞增殖水平相对于对照组，发生显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 上调CaMK Ⅱ N 基因表达对HL-60 细胞增殖的影响

2.3 CaMK Ⅱ N 基因过表达对HL-60 细胞凋亡的影响

CaMK Ⅱ N 转染24 小时HL-60 细胞发生明显皱缩的情况，粘附性明显降低，经荧光染色后可发现，转染CaMK Ⅱ N 基因的HL-60 细胞发生了明显的凋亡，并且随着时间的推移，凋亡的比例会继续增加，转染72 小时细胞凋亡率显著增加，显著高于空载体转染组、未转染组（P＜0.05），见表2。

表2 CaMK Ⅱ N 基因过表达对HL-60 细胞凋亡的影响

3.讨论

钙离子为一种重要的第二信使，钙/钙调素能够磷酸化多种酶，在细胞周期的转变中发挥了重要作用[5]。研究发现，CaMK Ⅱ N 为Ca2+/CaM 调节蛋白家族的重要成员之一，为多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其底物特异性较差，可对诸多蛋白、酶磷酸化产生催化作用，在各种信号的转导中，均有广泛参与，为Ca2+/CaM 在细胞周期不同时期转变过程中，均发挥了重要的靶分子作用[6]。

研究证实，CaMK Ⅱ抑制剂可对CaMK Ⅱ活性产生特异性的抑制作用，能够有效促进肿瘤细胞凋亡与坏死[7]。CaMK Ⅱ抑制剂还能够使肿瘤细胞对缺氧的敏感性降低，造成肿瘤细胞微环境血管生成受到抑制，使肿瘤细胞对、放化疗的敏感性予以增强。现阶段，针对CaMK Ⅱ抑制剂的研究多为化学性合成抑制剂，这一机制多利用抗CaMK Ⅱ与Ca2+/CaM 结合区相结合，造成CaMK Ⅱ无法磷酸化，进而处在失活状态[8]。但化学合成性抑制剂仅可以对无自身磷酸化的CaMK Ⅱ活性产生有效抑制，对自身磷酸化的CaMK Ⅱ活性不会产生明显影响。相对于化学性抑制剂而言，CaMK ⅡN 属于内源性CaMK Ⅱ抑制剂，能够产生对CaMK Ⅱ活性产生特异性抑制的效果，并且仅会与活化的CaMK Ⅱ发生相互作用[9]。

本文中，以对上调CaMK Ⅱ抑制蛋白表达对HL-60 细胞增殖的抑制作用及机制进行研究分析为目的，通过研究证实，人CaMK Ⅱ N 基因能够稳定转染HL-60 细胞；呈现出CaMK Ⅱ N 基因过表达的HL-60 细胞相对于空载体转染组、空白对照组，增殖明显受到抑制；细胞集落形成能力显著降低；转染72h，细胞凋率明增高。这一结果与相关文献[10]报道结果相似，由此证实，上调CaMK Ⅱ基因表达，可对HL-60 细胞增殖产生有效抑制，并诱导其凋亡。