蓖麻籽粒三酰甘油合成途径及关键酶研究进展

徐 瑶 ，刘俊羽 ，毛 爽 ，王英男 ，阎秀峰 ，蔺吉祥 ，2*

（1.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，生命科学学院，东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.东北林业大学园林学院，黑龙江哈尔滨150040）

蓖麻（Ricinus communis L.）是大戟科蓖麻属一年生草本植物，生长于热带和亚热带地区，有很强的生态适应性，对酸碱性土壤均有较好的适应能力，在我国东北地区有着较广泛的分布。与此同时，蓖麻也是多用途、经济效益高的油料作物，蓖麻油也被称为“绿色石油”，全世界范围内，蓖麻油年产量可以达到50 万吨[1]。但由于其含有蓖麻毒蛋白、蓖麻碱、蓖麻变应原等有毒物质，因此往往只用于工业产品的制备[2]。蓖麻籽油的主要成分是三酰甘油，种子油的品质主要由脂肪酸种类和比例决定。一般来说，蓖麻籽粒油含量主要含六种羟基脂肪酸，即蓖麻油酸（84%）、亚油酸（7.3%）、油酸（5.5%）、棕榈酸（1.3%）、硬脂酸（1.2%）和亚麻酸（0.5%）[3]。蓖麻种子油的结构中含有活性基团，因而可通过一系列化学反应，如环氧化、脱氢、氢化、脂化等得到不同的改性产品，并广泛应用于生物柴油、紫外光固化涂料、润滑剂、皮革加工助剂、泡沫塑料、水性聚氨酯等诸多领域[4，5]。因此，本文综述蓖麻籽粒三酰甘油合成途径和几种关键酶，为提高籽粒油含量提供依据。

1 蓖麻三酰甘油合成途径

蓖麻油中主要含有三种酰基甘油，依次为三蓖麻油酰甘油（RRR,Triricinolein）、二蓖麻油酰油酰甘油（ROR,1,3-Diricinoleoy-2-oleoyl-sn-glycerol）和二蓖麻油酰亚油酰甘油（RLR,1,3-Diricinoleoyl-2-linoleoyl-sn-glycerol）[6]。三酰甘油是蓖麻油主要积累形式，以油酰-CoA（Oleoyl-CoA）为原料在内质网中合成。

油酰-CoA 与溶血磷脂酰（LPC）反应生成中间产物1- 酰基 -2- 油酰基甘油（1-Acyl-2-oleoyl-sn-glycerol），经过油酰-12- 羟化酶（FAH12）、磷脂酶A2（PLA2）、长链脂酰-COA 合成酶（LACS）一系列催化反应生成蓖麻油酰 -COA 进入脂酰 -CoA 依赖途径中（Kennedy 途径）[7，8]。在甘油3 磷酸酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）的催化下将蓖麻油酰-COA 脂肪酸分别转移到甘油三磷酸（G-3-P）的sn-1 和sn-2 位置上分别形成蓖麻油酰—溶血磷脂酸和1,2- 蓖麻油酰磷脂酸。磷脂酸磷酸酶（PAP）脱去甘油三磷酸sn-3 位置上的磷酸生成多羟脂酰- 二酰甘油（1,2-Diricinoleoyl-PA），随后二酰甘油酰基转移酶（DGAT）将脂肪酸转至sn-3 位置上生成三蓖麻油酰甘油（RRR）[9，10]。在非脂酰 -CoA 依赖途径中，以蓖麻油酰-PC 为酰基供体，二酰甘油（DGAT）为受体，二酰甘油酰基转移酶（PDAT）将酰基基团转移至DAGsn-3 位点形成三酰甘油，同时释放LPC 再次进入合成途径中[11]。

中间产物1- 酰基-2- 油酰基以及去饱和生成2-亚油酰 -PC（2-Oleoyl-PC），在磷脂酶 C（PLC）和二酰基甘油酰基转移酶（DGAT） 的作用下生成 ROR 以及RLR。1- 酰基-2- 油酰基也可间接形成2- 亚油酰基-磷脂（2-Linoleoyl-PE） 和 2- 蓖麻油酰基 - 磷脂（2-Ricinoleoyl-PE）。但这两个去向在蓖麻体内被阻断或部分阻断[12，13]。

2 蓖麻三酰甘油合成关键酶

蓖麻三酰甘油合成途径中涉及的酶较多，但主要集中在二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）、蓖麻油酰-12- 羟化酶（FAH12）和磷脂：二酰基甘油酰基转移酶（PDAT）的研究中。

二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）是生物体内TAG合成过程的末端，也是该途径唯一的限速酶，其活性主要位于油体和内质网膜上[14]。人们在植物中共发现了三种类型的DGAT，其中蓖麻含有两种类型，分别为DGAT1 和DGAT2[15]。高等植物DGAT1 蛋白的氨基酸残基数多介于480～550，不同植物种类的DGAT 氨基端前100 个氨基酸残基相似性不高于20%，而这之后的残基相似性较高，一般会高于70%，分析其原因可能是由于N 端的不同进而引起的DGAT1 酶属性有所差异[16]。DGAT1 氨基酸序列中含有五个保守结构，包括N 端RRR 区、酰基辅酶A 结合信号区、脂肪酸蛋白信号区、DAG 结合位点和C 端内质网膜检测基序，此外，还存在一个亮氨酸重复序列是与蛋白互作有关的信号区域[17]。另外，目前已经知晓的植物DGAT2 蛋白氨基酸残基数约为320 个。通过分析序列可以看出，N 端的保守性不如C 端。多项研究表明，DGAT 在控制脂肪酸进入存储TAG 的定量和定性流动中起着至关重要的作用，并间接影响种子含油量、脂肪酸组成以及种子重量等多项参数[18]。例如，在DGAT1 过表达后，拟南芥和甘蓝型油菜的种子油含量增加[19，20]。土壤真菌伞形目单胞菌（Mortierella）DGAT2 在大豆中的异源表达导致其种子油含量增加[21]。因此，编码具有DGAT 活性蛋白质的基因以改善油料作物中的油含量和脂肪酸组成已成为生物技术的目标[22，23]。

在蓖麻油酸合成途径中，通过蓖麻油酰-12- 羟化酶（FAH12）的作用，将磷脂酰胆碱羟化形成蓖麻油酰基，其活性位置主要在内质网上[24，25]。FAH12 序列包含三个富含组氨酸的基序，在所有膜结合的去饱和酶中均保守，该结构域在这些酶的活性位点中很重要，可能是结合铁辅助因子的位点。研究表明FAH12 和拟南芥FAD2（油酸脱氢酶）氨基酸序列具有67%的同源性，证明了油酸羟化酶和油酸脱氢酶具有相似的反应机制，并且FAH12 基因在蓖麻叶中表达量很少，但是在种子发育过程中却可以高效表达[26]。RcFAH12 转基因拟南芥（Arabidopsis）在其种子油中积累了20%的羟基脂肪酸（HFA），但始终不稳定，后代种子发芽不良[27]。RcFAH12 也被引入芸苔科油料植物甘蓝型油菜和茶花种子中，转基因植株分别显示出15.6%和15%的HFA含量[28]。研究表明，当RcFHA12 单独表达时，转基因种子油中HFA 的最高和可遗传水平为17%，并且高水平的HFA 可能会损害种子的生理代谢，导致种子重量、活力以及油量损失[29]。

另外，在蓖麻种子中二酰基甘油酰基转移酶（PDAT）也对油含量起着重要的作用。PDAT 是一种不依赖酰基辅酶A 独立介导TAG 合成的酶。首先从酵母中鉴定出编码PDAT 的LOR1 基因，随后拟南芥同源基因PDAT1（At5g13640） 和 PDAT2 （At3g44830） 被 鉴 定 出[30]。PDAT1-2 与FAH12 表达相似，在发育的种子中表达并定位于内质网，参与了蓖麻油酸转化为TAG 生物过程。研究表明，蓖麻有三个PDAT 基因，分别为RcPDAT1-1、RcPDAT1-2 和 RcPDAT2。其中 RcPDAT1-1 和 RcPDAT2是植物中常见的PDAT 同源基因，但RcPDAT1-2 为蓖麻所特有的基因。在含FAH12 基因的拟南芥植株中表达RcPDAT1-2 提高种子中羟基脂肪酸（HFA）含量，并对植物的生长发育没有影响[31]。另外也有研究表明，从蓖麻籽cDNA 文库中克隆了编码PDAT 三种酶cDNA，在拟南芥中与RcFAH12 共表达，其中一个亚型RcPDAT1A 将羟基脂肪酸（HFA）水平提高了27%[32]。RcPDAT1A 与RcPDAT1-2 进行序列对比具有99%相同。上述研究表明蓖麻籽中特异性PDAT1-2 是转基因植物产生羟基脂肪酸的关键调控基因。

植物种子油及脂肪酸的合成积累是一个复杂的生理生化过程，涉及到众多酶基因及调节基因的协同表达，以及质体、内质网和细胞质等亚细胞结构的共同参与，但同时也受到种子发育和外界环境因素的影响[33]。之前有研究表明通过表达种子油生物合成途径上的酶基因或转录因子、转基因技术以及环境因子的调控增加油菜、大豆种子含油量[34，35]。但是少有报道通过生物技术手段增加蓖麻种子油含量，因此进一步研究蓖麻脂肪酸合成途径、关键基因具有重要意义。