铁皮石斛类原球茎提取物的护肤功效研究*

黄晓莉，韦 钰，张 琪，吴 琦，田长城

(蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是一种兰科石斛属的珍稀濒危药用植物，具有生津养胃、增强机体免疫力、抗肿瘤等功效[1]。由于自然繁殖率低、生长周期长等原因，铁皮石斛的产量一直难以满足工业化生产的需求，缩短铁皮石斛的生产周期已成为一个额待解决的问题。

在组织培养过程中，铁皮石斛会产生一种类似于原球茎的脱分化组织，称为类原球茎或拟原球茎(protocorm-like bodies，PLBs)[2]。类原球茎具有增殖快、生长周期短的特点。药物化学分析发现铁皮石斛类原球茎的成分与铁皮石斛相似，含有丰富的多糖、生物碱、酚类、氨基酸以及金属元素[3]。毒理学研究表明铁皮石斛类原球茎的最大损害剂量大于5.0 g/kg，相当于人体推荐量的300倍，是一种可利用的安全药食资源[4]。

《本草纲目》中记载铁皮石斛可以“长肌肉，逐皮肤邪热痱气”，表明铁皮石斛对皮肤疾病具有一定的防治功效。本研究分别采用冷榨、热水浸提和乙醇浸提的方式对铁皮石斛类原球茎进行提取，分析比较了不同提取物中的化学组成，并对它们的抗氧化性和抑制酪氨酸酶活性进行了评价。课题的开展拟为铁皮石斛类原球茎的开发和利用提供一定理论依据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

铁皮石斛类原球茎由蚌埠学院食品与生物工程学院组织培养获得，选取色泽浅绿、近球状个体为研究材料；雄性昆明种小鼠，蚌埠医学院实验动物养殖中心。

多酚氧化酶和Folin-Cioealteu试剂，源叶生物有限公司；熊果苷，麦克林有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；牛血清白蛋白，上海展云化工有限公司；三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

铁皮石斛类原球茎置于-20 ℃的冰箱中冷冻24 h以上，在低温条件下粉碎成浆，8层纱布过滤，滤液在6000 rpm条件下离心10 min，取上清液。加入1%(g/mL)的活性炭颗粒，搅拌吸附60 min，微滤膜(0.45 μm)抽滤，冷冻干燥，得到铁皮石斛类原球茎的冷榨物(CPS)。

铁皮石斛类原球茎冷冻干燥后粉碎，过100目筛，按料液比1:30(g/mL)加入去离子水，在95～100 ℃水浴下搅拌浸提2 h，8层纱布过滤，6000 rpm离心10 min；上清液加入1%(g/mL)的活性炭颗粒，搅拌吸附60 min，微滤膜抽滤，真空浓缩后冷冻干燥，得到水提物(AqE)；按上述方法用95%的乙醇替代去离子水进行回流浸提，得到铁皮石斛类原球茎的醇提物(AlE)。

1.2.2 提取物的组分分析

(1)总糖含量测定：利用苯酚-硫酸法测定不同样品中的总糖含量，以葡萄糖为标准品拟合回归曲线[5]。

(2)蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法测定样品中蛋白质的含量，以牛血清白蛋白为标准品绘制回归曲线[6]。

(3)总酚含量测定：总酚含量的测定采用Folin-Cioealteu法，以没食子酸为标准品[7]。

(4)pH值的测定：用蒸馏水配置2 mg/mL的提取物溶液，在室温下利用pH计(雷磁PHS-25)测定溶液pH值。

1.2.3 抗氧化活性

(1)DPPH自由基的清除

参照李春阳等[8]的方法，稍作修改，大致流程如下：准确配置0.004%的DPPH-乙醇溶液，吸取2.5 mL DPPH溶液和0.5 mL 不同浓度的样品溶液和Vc溶液，混匀后28 ℃水浴30 min，在515 nm处测定吸光度(OD样品)。以0.5 mL蒸馏水和2.5 mL无水乙醇反应体系为空白组(OD空白)，以0.5 mL样品溶液和2.5 mL无水乙醇作为对照组(OD对照)。清除率按下式计算：

(2)羟基自由基的清除

参照王玲等[9]的方法，大致流程如下：依次向试管中加入1.0 mL 0.15 mmol/L FeSO4、0.4 mL 2.0 mmol/L水杨酸、0.2 mL 不同浓度的提取物溶液和1.0 mL 6.0 mmol/L H2O2，最后用蒸馏水定容至3.0 mL，混匀，37 ℃水浴反应1 h，冷却；用蒸馏水调0，510 nm处测定吸光度(OD样品)；空白组用蒸馏水代替样品溶液(OD空白)，对照组用蒸馏水代替水杨酸(OD对照)。以抗坏血酸(Vc)做为阳性对照，羟基自由基的计算如下：

(3)脂质过氧化的抑制

参照鲍素华等[10]的方法，大致流程如下：小鼠处死后，摘取肝组织，制成10%的悬浮液，4000 r/min离心15 min，上清液即为肝组织匀浆液。向10.0 mL试管中依次加入0.2 mL肝组织匀浆液、0.2 mL的样品溶液、50 μL 0.5 mmol/L FeSO4和50 μL 0.5 mmol/L Vc，对照组用生理盐水替代肝组织匀浆，空白组则用生理盐水替代多糖溶液。反应液涡旋混匀后在37 ℃水浴1 h，加入2.0 mL 10%的TCA和1 mL 0.6%的TBA溶液，混匀后沸水中煮沸15 min，冰水冷却后3000 r/min离心15 min，取上清液在532 nm处测定吸光度，按下式计算抑制率：

1.2.4 酪氨酸酶抑制活性

参照韩强等[11]的方法，大致步骤如下：以pH 6.8的磷酸缓冲液(50.0 mmol/L)分别配制L-多巴(0.5 mmol/L)、酪氨酸酶(40.0 μg/mL)和不同浓度的样品溶液(0.5、1.0和2.0 mg/mL)，按表1精确吸取不同体积溶液，涡旋混匀后37 ℃水浴30 min，迅速在475 nm处测定吸光度。以熊果苷为阳性对照，酪氨酸酶抑制率按下式计算：

表1 反应液组成

1.2.5 致敏性评价

参照2015版《化妆品安全技术规范》中人体皮肤斑贴试验中的重复性开放型涂抹试验检测了铁皮石斛类原球茎不同提取物对人体皮肤不良反应的潜在可能性。根据要求选取了30名志愿者，样品浓度为10 mg/mL，每天2次均匀涂抹于前臂屈侧，连续涂抹7天，观察皮肤反应。

1.2.6 数据分析

每个试验重复3次，数据由OriginPro 8.0进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同提取物的组分

以铁皮石斛原球茎为对象，分别采用冷榨、热水浸提和乙醇浸提的方法进行提取，其中冷榨可以尽可能避免活性成份的失活，热水浸提则主要针对多糖以及部分对热不敏感小分子物质，而醇提则主要针对弱极性的小分子物质。研究结果表明：CPS中蛋白质和总酚的含量均高于其他两种提取物，同时含有较多的多糖，这表明冷榨方法较好地避免了几种活性成分的损耗，同时由于提取条件温和，也最大程度地保持了其结构的完整性。蛋白质和多糖均不溶于乙醇，所以AlE中总糖和蛋白质含量远远低于CPS和AqE，但酚类物质较多。

表2 不同提取物的化学性质

2.2 不同提取物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除

图1 不同提取物的DPPH自由基清除能力

比较了不同提取物对DPPH自由基的清除能力，结果表明：铁皮石斛类原球茎的三种提取物对DPPH自由基均有着清除作用，且呈现出较好的量效关系。在浓度为2.0 mg/mL时，CPS和AlE提取物对DPPH自由基的清除率分别为82.6%和78.6%，高于AqE的清除率(65.2%)，这一现象可能缘于两种提取物中较多的酚类物质。

2.2.2 羟基自由基的清除能力

羟基自由基(·OH)是活性氧类物质中最活泼的一种自由基，对生物体中细胞的危害极大[12]。实验利用Fenton反应进行·OH的诱导，进而评价提取物对自由基的清除能力。研究结果表明：三种提取物对羟基自由基均有着显著的清除效果，其中AqE的清除率最高，当浓度为2.0 mg/mL时，AqE的清除率达到了85.2%。

图2 不同提取物对羟基自由基的清除能力

2.2.3 脂质过氧化的抑制

Fe2+-Vc反应体系产生的自由基可以攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸，生成的丙二醛(MDA)与TBA形成的复合物在532 nm处有吸收峰，吸收值越大说明生成的MDA越多，酯质过氧化越严重。由图3可见，CPS和AqE对脂质过氧化都呈现出显著的抑制效果，而AlE的抑制效果则不是十分明显。从组分上看，CPS和AqE中较多的多糖组分可能在抑制脂质过氧化过程中发挥着重要的作用。

图3 不同提取物对脂质过氧化的抑制

2.3 不同提取物对酪氨酸酶的抑制作用

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1, tyrosinase)又称酚氧化酶、多酚氧化酶等，是一类含铜的氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物和人体内。酪氨酸酶能够催化单酚羟化成二酚，再氧化成醌，最终形成黑色素[13]。一些研究发现，植物中的提取物对酪氨酸酶有着显著的抑制作用，可以用来预防和治疗色素沉着和黑色瘤的形成[14]。

图4 不同提取物对酪氨酸酶的抑制作用

由图4可见，CPS对酪氨酸酶活性有着较好的抑制作用，且呈现出显著的量效关系。AlE与熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制相对较弱，AqE则呈现出对酪氨酸酶的激活作用。从结果可知，铁皮石斛原球茎中存在抑制酪氨酸活性的物质，但该物质对热敏感，加热反应后形成的产物可以激活酪氨酸酶的活性。

2.4 致敏性分析

人体皮肤斑贴试验显示，三种提取物对皮肤均不具有致敏性，是十分安全的皮肤外敷材料。

表3 不同提取物的致敏性

*0：阴性反应；1：微弱红斑、皮肤干燥、皱褶；2：红斑、水肿、丘疹、风团、脱屑、裂隙；3：明显红斑、水肿、水疱；4：重度红斑、水肿、大疱、糜烂、色素沉着或色素减退、痤疮样改变。

3 结 论

铁皮石斛类原球茎中富含多种活性成分，且具有生长周期短、规模化生产简单的特点，可做为野生铁皮石斛的替代物用于工业化生产。研究发现冷榨法可以最大程度的避免铁皮石斛类原球茎中活性成分的流失，提取物不仅可以有效清除自由基、抑制细胞膜的脂质过氧化，同时还对酪氨酸酶的活性有着显著的抑制作用。以上结果表明，铁皮石斛类原球茎中含有的活性成分对皮肤的防护、美白可能具有一定的功效，是一种颇具开发潜力的天然资源。