木聚糖酶原位协同水解预处理大米草的研究

杨旸，刘健，甘礼惠，龙敏南

(厦门大学 能源学院，福建 厦门 361102)

目前，利用半纤维素获取木寡糖的常用方法为酶水解。相较于其他方式[1-2]，酶水解污染小且产生的副产物少[3-4]。然而由于生物质结构复杂，直接酶解的效率低[5]，故实验使用了氨水/双氧水与球磨相结合的方式预处理大米草，在脱除木质素的同时保留了相当量的半纤维素，并破坏其结晶结构。

大米草中除木聚糖外还含有2.13%的侧链阿拉伯糖[6]。因此，实验选择了源于黑曲霉，在毕赤酵母中高效表达的重组内切-β-1，4-木聚糖降解酶和重组α-L-阿拉伯糖苷酶水解经预处理后的大米草。探究了氨水/双氧水与球磨预处理方式相结合及协同酶解对大米草木聚糖水解效率及协同降解机制的影响。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大米草，收割于福建省厦门市翔安区沿海滩涂，粉碎至40～60目；氨水(25%～28%)、双氧水(30%)、硫酸(98%)均为分析纯；柠檬酸缓冲液(50 mmol/L，pH 5)；实验所用酶为实验室保存重组内切-β-1，4-木聚糖降解酶(AnXyn10C，XC，306 IU/mL，GenBank accession No.KJ601783)，α-L-阿拉伯糖苷酶(AnAxh62A，AX，38.9 IU/mL，GenBank accession No.KJ601782)来源于黑曲霉，在毕赤酵母中高效表达。

FIWE 纤维素测定仪；QM-3Spartina04 行星式球磨机；Rigaku ULTIMA IV X射线衍射仪；Nicolet iS5 傅里叶变换红外光谱仪；SUPRA 55 场发射扫描电镜；Molecular Devices美国M2多功能酶标仪；Waters2695 高效液相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 氨水/双氧水预处理 称取2 g大米草，32 g去离子水，2 g双氧水及6 g氨水，加入120 mL(46 mm×130 mm)耐压瓶中。充分浸泡后的混合物分别在110，120，130 ℃的恒温油浴锅中反应1，3，4，5，6 h。反应结束后过滤分离固体，并用去离子水多次冲洗固体至中性，在75 ℃下烘至绝干，称重后置于干燥皿室温保存待用。

1.2.2 球磨预处理 称取200 mg氨水/双氧水预处理大米草及原料大米草于玛瑙球磨罐，400 r/min下球磨2 h。球磨后的固体置于干燥皿室温保存待用。

1.2.3 酶水解 准确称取200 mg底物于离心管，分别或同时加入135 μL的AnXyn10C与46 μL的AnAxh62A，再添加柠檬酸缓冲液至固∶液=1∶100(g/mL)，在50 ℃恒温混匀仪中300 r/min反应24 h。反应结束后将离心管置于沸水中煮10 min灭活，再置于离心机，12 000 r/min离心5 min，收集上层清液，-20 ℃ 冷冻保存待用。计算木聚糖水解率。

木聚糖水解率=10C/S

式中C——酶水解产物中还原糖浓度，mg/mL；

S——预处理后固体中剩余的半纤维素含量，%。

1.3 结构与表征

1.3.1 化学组成分析 原料大米草及预处理大米草的成分确定方法参考NREL方案[7]。酶水解液中的成分由带有紫外检测器及C18柱(CAPCELL PAK C18MGⅡ)的高效液相(HPLC)分析确定，方法参考文献[8]。

1.3.2 SEM分析 原料大米草及预处理大米草的表面形态由场发射扫描电子显微镜(SEM)观察。所有样品粉末经过喷金处理，在20 kV下操作。

1.3.3 XRD分析 将原料大米草及预处理大米草于红外干燥箱下干燥2 h，用玛瑙研磨皿充分研磨至粉状待测。测试条件：Cu靶(Kα=0.154 nm)，管电流40 mA，管电压40 kV，扫描率为3(°)/min，从10～60°。

1.3.4 FTIR分析 将原料大米草及预处理大米草与KBr按1∶100(w/w)混合，在红外烘干箱中研磨至粉末状。用傅里叶变换红外光谱仪进行分析，测试条件：4 000～500 cm-1波数范围，32次扫描，所有情况下光谱分辨率保持在4 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 氨水/双氧水预处理大米草的化学组成

原料大米草的组成为纤维素34.04%，半纤维素26.45%，木质素25.73%，水分含量约9.80%。由表1可知，经过不同碱预处理后，大米草的固体回收率为49.00%～57.01%。其中固体的损失主要是由于生物质在碱预处理中有部分成分溶解，如木质素及半纤维素等。大部分的纤维素及相当量的半纤维素被保留在了固体中，尤其是纤维素，大米草中超过95.00%的纤维素被保留了下来，没有受到碱预处理的影响。这是由于氨水对纤维素/半纤维素低反应性[9]的结果。由表1可以看出，最高和最低的木质素脱除率分别为73.39% 及 61.75%，分别在碱处理条件为120 ℃，6 h 和 120 ℃，1 h 时发生。木质素的脱除主要是由于氨破坏了木质素分子间的酯键，而双氧水通过其氧化作用加速了这一过程[9-10]。这些结果说明，氨水/双氧水的预处理可以在保留相当量的纤维素/半纤维素的情况下，脱除大部分的木质素，而木质素的脱除程度则随着预处理条件的加剧而增大。由表1中还可以看出，碱预处理温度从110 ℃ 升至130 ℃，木质素脱除率从65.36% 升到 68.87%，尽管木质素脱除量增加，但纤维素/半纤维素损失也随之增大。这说明严苛的氨水/双氧水预处理条件尽管有利于木质素的脱除，但同时也会导致纤维素/半纤维素的损失增大，从而使后续酶水解的糖得率降低。

表1 经不同碱预处理条件处理的底物的化学成分

2.2 预处理大米草结构的表征

2.2.1 SEM 由图1a可知，大米草原料微观呈杆状，相较其他两组表面更光滑，原料经球磨后破碎成硬质细小颗粒状分散，见图1b。由图1c可知，经过碱预处理的大米草，结构被一定程度的破坏，其微观形态虽然不如球磨处理物细小，但呈更为松散的絮状物状态。从酶解效率来说，底物结构破坏程度越大，酶对底物的可及性越高，酶解效率也就越高。因此，无论经过碱处理还是球磨处理，都有利于后续的酶解效率的提高。

图1 原料(a)、经球磨处理的原料(b)、120 ℃，4 h 碱预处理的大米草(c)的扫描电子显微镜图片Fig.1 SEM micrographs of raw material(a)，raw material through ball-milling(b)，120 ℃，4 h alkaline-treated condition Spartina (c)

2.2.2 XRD 经过球磨处理的大米草及其原料的结晶情况，XRD分析见图2。

图2 原料(a)、120 ℃，4 h 碱预处理的大米草(b)、经球磨处理的原料(c)的X射线衍射图

由图2可知，最大的峰 2θ=22°代表了天然纤维素(002)衍射面[9]，小峰 2θ=34° 代表了(004)衍射面，这个峰在球磨预处理的底物图2b中不再明显，说明结晶区有所破坏。而在经过球磨预处理的底物图2c中则已经被完全消失。可知，球磨对生物质底物结晶度的破坏明显，这是因为球磨对纤维素的结晶区域具有破坏作用[11]。

2.2.3 FTIR 图3是不同处理条件下底物的红外分析谱图。

由图3可知，3 400 cm-1代表生物质中吸附的水分子的O—H伸缩振动峰；2 910，1 420 cm-1主要对应的是对称和不对称的C—H伸缩振动；1 060 cm-1附近的两个峰与碳水化合物的C—O和C—H伸缩振动有关[12]；895 cm-1与纤维素中的C—H 振动有关，是纤维素的吸收特征峰；1 260 cm-1是木质素酯键的C—O—C振动造成的。可知无论是球磨，还是氨水/双氧水的预处理，基本都不改变底物的成分，只改变组分含量。

图3 原料(a)、经球磨处理的原料(b)、120 ℃，4 h碱预处理的原料(c)的傅里叶红外光谱图

2.3 预处理对木聚糖降解酶协同作用的影响

大米草经过氨水/双氧水120 ℃预处理4 h时，酶解还原糖得率见表2和图4，碱预处理结合球磨处理的大米草酶解还原糖得率见表3和图5。

表2 碱预处理底物的还原糖得率

图4 经不同温度(4 h)、不同时间(120 ℃)碱预处理的底物及原料的酶解所得还原糖浓度Fig.4 The reducing sugar concentration of substrate just pretreated by alkali at different temperatures(4 h)， at different time (120 ℃) and raw material

由表2及表3可知，经过球磨预处理的底物，协同酶解所得的还原糖浓度是没有经过球磨的近7倍，未经过球磨的底物即使在木质素脱除率很高的情况下，半纤维素仍然没有很高的协同酶解率(表2)，由图4可知，两种木聚糖降解酶间的协同作用并不明显。这主要是由于碱预处理无法破坏纤维素的结晶结构，而这些结晶结构阻碍了木聚糖降解酶对半纤维素的可及性。

表3 碱预处理结合球磨处理底物的还原糖得率Table 3 The reducing sugar yield of alkali pretreatment conditions that combined with ball-milling

注：只经球磨处理的大米草。

由图5可知，两种酶协同的效果优于单独使用其中一种酶。这主要是因为AnXyn10C能够切断木糖单元间的β-1，4糖苷键，从木聚糖主链上释放木单糖[13]，Axh62A则能通过水解木聚糖侧链上阻碍AnXyn10C作用于主链的阿拉伯糖基来改善水解效果[14]。在110 ℃、碱预处理4 h结合球磨，木聚糖降解酶的协同酶解可以得到最高的还原糖得率。故选择110 ℃、4 h作为酶解底物的预处理条件，通过液相分析可知，水解物成分木糖占12.54%，木二糖占40.38%，阿拉伯糖占4.65%。说明经过预处理的底物由木聚糖降解酶协同酶解，除了产生木糖外，更多产生具有高附加价值的木寡糖。

图5 经不同温度(4 h)、不同时间(120 ℃)碱预处理结合球磨(BM)预处理的底物及原料(R)酶解所得还原糖浓度

3 结论

(1)氨水/双氧水预处理能够有效脱除大米草中所含的木质素，有利于后续木聚糖降解酶的水解，但对纤维素的结晶结构无影响。

(2)球磨预处理可以破坏生物质所含纤维素的结晶区域，从而降低底物的结晶度，使得木聚糖降解酶对底物的可及性增大。故球磨与氨水/双氧水预处理相结合可促进木聚糖降解酶的酶解。

(3)实验室的重组木聚糖主链酶及侧链酶可以结合氨水/双氧水及球磨预处理更大程度的发挥对大米草的协同酶解效果。生产具有高附加价值的木寡糖和阿拉伯糖。