青海省部分规模化奶牛场乳房炎主要病原菌调查分析

王 军，陈广宏，何寿昕，张红见 ，张 寿

（1.青海省湟中县畜牧兽医站，湟中 810004；2.青海大学，西宁 810016）

奶牛乳房炎（Mastitis）又称乳腺炎，是国内奶牛养殖业的一大顽疾，可给奶牛生产造成巨大经济损失。引起奶牛乳房炎的病原菌有数十种之多，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占所有病原菌的90%以上，而大肠杆菌性乳房炎一年四季均可发生，发病率相对较高[1]。目前，由大肠杆菌引起的奶牛乳房炎逐渐增加，特别是奶业发达国家，大肠杆菌性奶牛乳房炎发病率已经达到了28.39%。我国由大肠杆菌引起的奶牛乳房炎的比例也特别高，如佛山地区大肠杆菌性乳房炎发病率达到了50%，兰州地区达到了24.44%[2]。近年来，青海省奶牛养殖产业逐渐扩大，奶牛存栏急剧增加，乳房炎的发病率也居高不下，导致奶牛的淘汰率上升，牛奶品质降低，严重影响奶牛养殖业的发展。因此本研究对青海省部分规模化奶牛场引起奶牛乳房炎的主要病原菌进行了调查，并对主要病原菌进行了鉴定和药敏试验，以期为当地乳房炎的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 样品来源

本试验于2018年8月份随机收集青海省湟中县、大通县、乐都县、湟源县的5个规模化奶牛养殖场乳房炎患牛乳头的乳汁、腹泻犊牛的肛拭子、运动场地面拭子、产房各个位置拭子、挤奶台及挤奶机拭子，共142份样品装入无菌采集管中进行编号，置-20℃冰箱备用。

1.1.2 试剂

营养肉汤（HB0108)、营养琼脂（HB0109）、伊红美蓝（EMB)琼脂（MC03807）等试剂均购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。革兰氏染色液、26种生化鉴定管等购自于北京路桥技术股份有限公司。

药敏纸片10种，分别是氟苯尼考、头孢他啶、万古霉素、阿莫西林、氨苄西林、痢特灵、复方新诺明、丁胺卡那、链霉素、青霉素，10种药敏纸片均购自于北京路桥技术股份有限公司。

1.1.3 试验主要仪器

隔水式恒温培养箱（PYX-DHS-50＊65；上海市跃进医疗器械一厂），恒温恒湿箱（LHS-250HS-1；上海一恒科技有限公司），恒温气浴摇床（THZ-92B；金坛市仪器公司），-80℃超低温冰柜（8525型；美国Forms Scintific公司）。

1.1.4 实验动物

健康昆明系小鼠50只（不分雌雄），均购自于西宁市城北兴慧养殖场。

1．2 方法

1.2.1 样品增菌处理

用移液管分别无菌吸取采集管中的乳汁样品加到灭菌的营养肉汤小试管中，用无菌的镊子夹取采集管中的棉拭子加到灭菌的营养肉汤小试管中，置37℃回旋式气浴震荡器恒温培养18～24h。

1.2.2 细菌的分离

分别在超净工作台上用接种环无菌勾取上述增菌培养液1～2环，划线接种于选择性培养基（SS培养基平板、EMB培养基、BP培养基平板、鲜血琼脂培养基），置于37℃恒温培养箱培养18～24h后观察菌落形态。

1.2.3 目的菌的纯化与移植

挑取在选择性培养基上的可疑菌落进行革兰氏染色、镜检并进行多次纯化，将已经纯化好的细菌分别接种在营养琼脂斜面上，置于37℃恒温培养箱中培养18～24h后置于4℃冰箱中备用。

1.2.4 生化鉴定

将已经纯化的细菌分离株分别无菌接种到葡萄糖等26种生化鉴定管中，置于37℃恒温培养箱中24～48h后，观察并记录结果。

1.2.5 毒力试验

将健康昆明系小鼠进行标号，分别腹腔接种不同样品中分离纯化后的目的菌，观察小鼠24h内的发病及死亡情况，并对死亡小鼠立即进行剖检，取心、肝、肾、肺进行组织触片、染色、镜检。

1.2.6 药敏试验

将已纯化的细菌分别接种到普通琼脂斜面上，在37℃培养箱中培养18～24h，然后用生理盐水无菌冲洗斜面，与麦氏比浊管进行比浊后选取一定浓度的细菌悬液，用灭菌的棉签蘸取菌液，把多余的菌液在试管内壁上挤去，在MH（A）培养基上均匀涂布，涂布整个平板的1/3后将平板旋转60°后，再进行涂布，直到涂满整个平板，连续涂3次。最后用无菌的镊子夹取10种药敏纸片贴在涂好菌液的培养基上，每块培养基贴3片，置于37℃恒温培养箱中先正置培养30min，再倒置培养18～24h后进行结果判定（参照CISI药敏纸片扩散法标准进行判定）。

2 结果

2．1 样品增菌处理

用移液管分别无菌吸取采集管中的乳汁样品加到灭菌的营养肉汤小试管中，用无菌的镊子夹取采集管中的棉拭子加到灭菌的营养肉汤小试管中，置37℃回旋式气浴震荡器恒温培养18～24h后部分试管液体变混浊。

2．2 细菌分离

将上述试管中变混浊的菌液用无菌的接种环勾取2～3环分别接种于选择性培养基（SS培养基、EMB培养基、BP培养基、鲜血琼脂培养基）上，置于37℃恒温培养箱中培养18～24h后能长出不同的菌落，挑取疑似大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的可疑菌落进行纯化，最后得到目的菌共28株（表1）。

表1 疑似大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的分离情况

2．3 菌落形态及染色特性

2.3.1 大肠杆菌

疑似菌在SS培养基上生长呈现红色或粉红色菌落，在EMB培养基上生长呈现深紫色，并且带有金属光泽。革兰氏染色呈阴性，细菌形态为短小的杆状并且单个存在（图1、图2）。初步判定为大肠杆菌。

图1 疑似大肠杆菌菌落形态

图2 疑似大肠杆菌镜下形态（100×10油镜）

2.3.2 金黄色葡萄球菌

图3 疑似金黄色葡萄球菌的菌落形态

图4 疑似金黄色葡萄球菌镜下形态（100×10油镜）

疑似菌在BP培养基上生长呈现黑色、凸起菌落，在普通营养琼脂上呈现白色光滑、不透明的菌落，放置3～4d后菌落有明显的金黄色。革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈葡萄状排列，无芽孢、荚膜（图3、图4）。初步判定为金黄色葡萄球菌。

2.3.3 链球菌

疑似菌在鲜血琼脂培养基上呈现灰色、表面凸起的细小菌落。革兰氏染色为圆形或是卵圆形呈链状排列的阳性菌（图5）。初步判定为链球菌。

图5 疑似链球菌镜下形态（100×10油镜）

2．4 生化鉴定

将分离得到的分离株分别无菌接种到葡萄糖等26种生化反应管中，置于37℃恒温培养箱中48h，分别确定为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌。

2．5 毒力试验

腹腔接种金黄色葡萄球菌疑似菌、大肠杆菌疑似菌和链球菌疑似菌小鼠表现为厌食、精神沉郁，随之在24h内全部死亡。对小鼠进行剖检，可见明显败血症症状，肠道出血，黏液呈黄色，回收脏器触片染色、镜检，其形态与接种菌一致。

2．6 药敏试验

检测结果显示，大肠杆菌对氟苯尼考高度敏感，对头孢他啶、丁胺卡那比较敏感，对青霉素、链霉素等其他药物基本耐药。金黄色葡萄球菌对万古霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢他啶敏感，对其他药物基本耐药。链球菌对阿莫西林、氨苄西林敏感，对其他药物耐药。

3 讨论

从本次调查的结果可以看出，引起乳房炎的细菌主要是大肠杆菌（14.08%），其次为金黄色葡萄球菌（4.23%）和链球菌（1.41%），这与有关资料报道[1～3]的基本一致，但检出率较低。分析此原因主要是，乳房炎的发生与当地的气候和牛场的卫生状况具有很大的关系，本次试验采取样本时间在8月份，也是青海省气候条件最好时期，光照时间长且紫外线强，这可能是本次试验细菌检出率较低的原因。在所检测的5个奶牛场中，卫生条件较差的奶牛1场细菌的检出率相对较高。可见，加强环境的卫生治理是降低乳房炎发病率的有效途径之一。

大肠杆菌是奶牛乳房炎、子宫内膜炎等疾病的主要致病菌之一，同时也是威胁人类食品安全的主要细菌。金黄色葡萄球菌也是引起奶牛发生乳房炎的致病菌，常引起慢性和亚临床型奶牛乳房炎，同样会严重威胁人类健康，如发生金黄色葡萄球菌性乳房炎时，乳汁中会有大量的金黄色葡萄球菌，尽管加工过程中细菌会死亡，但其分泌的毒素仍残留在乳汁中，一旦食用就会引起毒素中毒，引起严重腹泻、肠炎甚至死亡[4]。在兽医临床上随着抗菌药物的大范围使用，导致细菌的耐药现象日益严重[5]，所以极易形成耐药性。从本次实验中的药物耐药性可以看出，导致奶牛乳房炎的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌都已经对常用的青霉素、链霉素产生了极强的耐药性。这提示奶牛场在平时的治疗过程中，应避免长期大剂量应用同一类型抗生素，只有科学用药才能提高治疗效果，保障食品安全。