嘉宝果果皮提取物不同极性部位抗氧化活性研究

林宝妹， 洪佳敏， 邱珊莲， 郑开斌， 张 帅

(福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建漳州 363005)

嘉宝果(MyrciariacaulifloraBerg.)，又名珍宝果、树葡萄、拟爱神木，为桃金娘科(Myrtaceae)拟爱神木属(Myrciaria)常绿灌木，是原产巴西的一种常见果树，现在我国台湾省、福建省、广东省等多个地区均有种植[5]。果实营养成分丰富，富含多种维生素及微量元素，例如维生素B2、抗坏血酸(维生素C)、锌、钙、铁等[6]。果皮富含花青素、单宁、黄酮醇等酚类化合物，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、消炎、抗菌等多种生物活性[7-10]。目前已有多种嘉宝果果实加工品如果酒、果酱、果脯等在售，市场前景较好。目前对嘉宝果果皮抗氧化活性的研究主要是果皮粗提物或者直接应用果皮冻干粉，而对果皮粗提物的分离及抗氧化活性组分进行筛选的研究较少。本研究采用不同极性的有机溶剂对嘉宝果果皮提取物进行分级，通过测定总多酚含量并以清除DPPH·自由基、ABTS+自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基对各极性部位的抗氧化性进行评价，为嘉宝果果皮的研究与利用提供理论基础与方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料

嘉宝果成熟果实采自福建省龙海市惠昌嘉宝果专业合作社，供试嘉宝果品种为“沙巴”。

1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：L5S型，上海仪电分析仪器有限公司生产；超纯水机：UPW-20N型，北京历元电子仪器有限公司生产；分析天平：BS110S型，德国Sartorius集团生产；粉碎机：WBL2521H型，佛山美的集团生产；数控超声波清洗仪：KQ-300DE型，昆山市超声仪器有限公司生产；冷冻高速离心机：MIKRO-22R型，德国Hettich生产；台式冷冻恒温振荡仪，THZ-C-1型，苏州培英实验设备有限公司生产；旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂生产。

1.3 嘉宝果果皮提取物不同极性部位制备

1.3.1 嘉宝果果皮提取物制备 嘉宝果成熟果实去籽和果肉→嘉宝果果皮→60 ℃烘干至恒质量→粉碎，过40目筛→提取溶剂70%乙醇、料液比 1 g ∶60 mL、28 ℃、180 r/min振荡提取20 h→28 ℃、120 W超声波提取20 min→8 000 r/min离心15 min→取上清液待用。

1.3.2 不同极性部位制备 取“1.3.1”节制备的提取液→50 ℃旋转蒸发仪旋蒸至无醇味→以超纯水稀释浓缩液至原提取液体积→依次以乙酸乙酯、正丁醇按照1 ∶1体积比萃取3次→合并萃取液→40～65 ℃ 旋转蒸发仪除去溶剂→获得乙酸乙酯相、正丁醇相以及萃取后剩下的水相，重新溶解各极性部位，以原材料质量浓度表示各极性部位质量浓度，单位为mg/mL。

1.4 总多酚含量测定

参考Wang等的福林酚法[11]，并修改如下：将不同极性部位提取物用超纯水稀释成10 mg/mL，取0.1 mL样品于试管中，再加入0.1 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu试剂和2.8 mL水，混匀，静置8 min后加入2 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀，室温下密封避光2 h，于765 nm处测吸光度，试验重复3次。按照上述方法，以没食子酸为标准品，以没食子酸质量浓度为x轴，吸光度为y轴，绘制回归曲线。不同极性部位提取物的总多酚含量以1 g原材料含有的没食子酸质量计，单位为mg/g。

1.5 抗氧化能力测定

1.5.1 DPPH·清除能力 参照Tang等的方法[12]并稍作修改，具体如下：分别取0.5 mL样品于试管中，再加4.5 mL 0.13 mmol/L DPPH·的95%乙醇溶液，摇匀后置于暗处反应30 min，于 517 nm 处测定吸光度D1；同时设置空白对照组D0(以超纯水代替样品)和样品本底组D2(以95%乙醇代替DPPH·溶液)，试验重复3次，求其平均值，计算DPPH·清除率。按照上述方法测定维生素C对DPPH·的清除率。

DPPH·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

1.5.2 ABTS+清除能力 参照Seczyk等的方法[13]并稍作修改：配制ABTS+反应工作液，7 mmol/L ABTS+与2.45 mmol/L过硫酸铵等体积混合，暗处静置12 h，以95%乙醇稀释至吸光度为0.7±0.05，为反应工作液。取0.1 mL样品于试管中，加入 3.8 mL ABTS+反应工作液，摇匀后置于暗处反应 6 min，于734 nm处测定吸光度D1，同时设置空白对照组D0(以超纯水代替样品)和样品本底组D2(以95%乙醇代替ABTS+反应工作液)，试验重复3次，求其平均值，计算ABTS+清除率。按照上述方法测定维生素C对ABTS+的清除率。

ABTS+清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

1.5.3 ·OH清除能力 参考刘晓飞等的方法[14]，并稍作修改，具体如下：2 mL pH值7.4的磷酸盐缓冲液和0.5 mmol/L邻二氮菲70%乙醇溶液、0.5 mmol/L 硫酸亚铁、样品各1 mL依次加入试管中，再加入1 mL 0.1%过氧化氢溶液，于37 ℃水浴中反应1 h，反应结束后于510 nm处测定吸光度D1，同时设置损伤组D2(以超纯水代替样品)、未损伤组(以超纯水代替过氧化氢溶液和样品)D0，样品本底组D3(以超纯水代替反应试剂)试验重复3次，求其平均值，计算·OH清除率。按照上述方法测定维生素C对·OH的清除率。

·OH清除率=[1-(D1-D2-D3)/(D0-D2)]×100%。

1.6 统计分析

试验数据采用Excel 2007进行回归曲线的制作；采用SPSS 22.0统计软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

以不同质量浓度没食子酸测得的吸光度建立回归方程：y=1.668x+0.079(r2=0.995 5)，由图1可见，没食子酸在质量浓度0.100～0.500 mg/mL 内与吸光度有良好的线性关系。

2.2 果皮提取物不同极性部位总多酚含量

由图2可见，嘉宝果果皮粗提液不同极性部位总多酚含量在5.895～41.287 mg/g，其含量从高到低依次为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位，乙酸乙酯部位和正丁醇部位的总多酚含量较为接近，乙酸乙酯部位总多酚含量为(41.287±0.421) mg/g，正丁醇部位的总多酚含量为(36.211±0.240) mg/g，水部位含量最低，为(5.895±0.092) mg/g，水部位仅约为乙酸乙酯部位多酚含量的1/8。

2.3 果皮提取物不同极性部位抗氧化能力

2.3.1 DPPH·、ABTS+、·OH清除能力 由图3、图4、图5、表1可知，在试验的浓度范围内，果皮提取物各极性部位对DPPH·、ABTS+、·OH等3种自由基的清除作用随着提取物浓度的增加而增强，二者呈线性关系，r2>0.98。且各极性部位对以上3种自由基的清除能力相差较小，回归曲线斜率相近，EC50值较为接近，但仍有以下区别：正丁醇部位和乙酸乙酯部位对DPPH·、ABTS+、·OH 自由基的清除能力大小顺序依次均为DPPH·>ABTS+>·OH，而水部位对以上自由基的清除能力大小顺序为DPPH·>·OH>ABTS+，即水部位清除·OH的能力大于清除ABTS+。清除DPPH·、ABTS+、·OH 自由基能力大小依次为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。表1、表2结果表明，抗氧化剂(维生素C)对DPPH·和ABTS+自由基的清除能力大于各极性部位，但清除·OH自由基的能力弱于乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

表1 嘉宝果果皮提取物不同极性部位自由基清除效果的比较

注：―表示在试验条件下未测得。

表2 维生素C清除 等4种自由基效果的比较

2.4 抗氧化与总多酚含量的相关性

表3 抗氧化与总多酚含量的相关性

注：*表示达显著相关(P<0.05)；**表示达极显著相关(P<0.01)。

3 讨论与结论

正常情况下人体内自由基的产生与消除处于动态平衡中。适当数量的自由基不但对人体无害，而且参与体内能量传递、炎症消除、抑制肿瘤等重要过程。自由基的数量过多，会破坏机体细胞结构，引起脂质过氧化，干扰正常代谢活动，与糖尿病、心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等的发生发展密切相关[16-17]。除机体自身的自由基清除系统如抗氧化酶、维生素、激素等，许多天然产物中富含的小分子如维生素C、维生素E、β-胡萝卜素以及各种多酚等均能有效清除自由基，帮助人体抵御过量自由基造成的危害，对这些天然产物进行抗氧化功能评价，有利于天然抗氧化剂的开发应用。本课题组前期研究发现，嘉宝果果皮醇提取物能有效清除DPPH·、·OH及ABTS+等自由基，表现出较好的抗氧化性，但未对果皮醇提取物进行分部位有效性研究。

本研究以嘉宝果果皮为原料，以不同极性有机溶剂依次萃取果皮醇提取物获得提取物乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。通过4种不同方法检测各极性部位的抗氧化活性并测定其多酚含量，结果发现，各极性部位中以乙酸乙酯部位抗氧化活性最强，总多酚含量最高，清除·OH的能力甚至超过了维生素C，表现出极强的羟自由基清除能力，具有抗氧化剂开发价值。本研究结果可为今后嘉宝果果皮多酚的开发利用提供一定的参考。