外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗的生理效应

华智锐，李小玲

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

黄芩(Scutellariabaicalensis)又叫山茶根，是唇形科黄芩属多年生的草本植物，黄芪的根可以清热、下火、除湿、安胎，也有一定的解毒作用[1-3]。人工种植黄芩成为了国内黄芩产量的主要来源,但不合理的种植方式、环境恶化等因素，使盐渍化土地面积越来越大，影响到了黄芩的产量和质量。因此，如何能使黄芩在盐渍化环境下正常生长并能使黄芩生长、发育和产量、品质得到提高，对药用植物耐盐性、抗盐生理和抗性育种及合理高效利用盐渍化土壤均具有重要意义。盐渍化的土地主要影响作物的萌发及生长、对水分吸收和生物膜通透性[4-5]。

细胞胞内的第二信使Ca2+能够与钙调素(CaM)作用，在植物生长过程中的信号传递方面发挥作用[6]。同时钙离子也能稳定生物膜的结构，维持细胞膜的完整性，其作用原理是它把生物膜表面的磷酸酯与蛋白质的羟基相结合。钙在作物对有机物的选择性吸收、生长发育、信号的传递以及作物的耐盐性方面发挥着重要的功能[7-8]。所以高盐环境下加入一定浓度的外源钙，不仅能够提高细胞质膜的稳定性，保持钙信号通路的正常传递，以达到维持细胞内各种离子动态平衡的目的，还可以解决因钙离子浓度不够造成的矿物质营养缺失问题。

当前关于Ca2+对高盐条件下植物生理特性影响的研究主要还是集中在玉米、甜菜[9]、小麦[10]等作物方面，但是对具有极高药用价值的作物方面，通过施加外源物缓解盐渍伤害的报道比较少，因此探寻一种效益高、低成本提高黄芩抗逆性的方法，对药用植物黄芩具有重要的现实意义。本研究用商洛一年生黄芩幼苗为材料，探寻了Ca2+对盐胁迫下黄芩的生理效应，以期为黄芩的抗性生理研究、大田生产和合理施肥等提供一定的理论依据和现实参考。

1 材料与方法

1.1 材料

商洛一年生黄芩幼苗，2019年4月6日移栽于直径为50 cm的花盆中，每盆3～4株，共移栽21盆。

1.2 试验方法

1.2.1 预试验 用不同浓度梯度的NaCl倍液(0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)处理黄芩一年生盆栽幼苗，测定分析其生理指标的变化趋势，确定黄芩幼苗耐盐胁迫阈值。

1.2.2 材料处理 经过预试验得出了黄芩幼苗耐盐胁迫阈值，以阈值的NaCl浓度模拟盐胁迫环境，待黄芩幼苗生长两周后，将实验材料分为7组。试验共设2个对照和5个处理：CK1(蒸馏水对照)；CK2(盐胁迫对照)；T1(0.2 mmol/L CaCl2+盐胁迫阈值)；T2(0.4 mmol/L CaCl2+盐胁迫阈值)；T3(0.6 mmol/L CaCl2+盐胁迫阈值)；T4(0.8 mmol/L CaCl2+盐胁迫阈值)；T5(1.0 mmol/L CaCl2+盐胁迫阈值)。将长势一致的黄芩幼苗移栽到经过以上试验处理的花盆中，每盆种植3～4株，每个处理种植3个花盆。用不同浓度的CaCl2和盐胁迫阈值每次各喷施2 mL，每2 d喷施一次，喷洒强度为密布叶面而不下流。分别在胁迫4、8、12 d后采集叶片，测定黄芩叶片的MDA含量、脯氨酸含量、SOD、POD和CAT活性的变化。

1.3 测定指标与方法

保护酶的测定参照高俊凤等[11]的方法；MDA 含量的测定参照赵世杰等[12]的方法；渗透调节物质的测定采用蒽酮比色法。

酶液的制备：称取0.5 g黄芩叶片，洗净擦干水分，研磨，匀浆移入10 mL离心管中，用冷冻离心机离心20 min，转速为10000 r/min。上清液即为酶液，置于0～4 ℃下保存待用。

1.3.1 SOD活性的测定 用移液枪取20 μL的酶液，用移液管加入3 mL SOD反应液，光照(4000 lx)30 min，设3个对照、1个空白；空白避光保存，对照组与酶液照光(4000 lx)30 min，遮光保存；使用分光光度计在560 nm下比色。

SOD总活性(吸光度/g)=(ACK-AE)×V/(W×0.5×ACK)，ACK为对照管(光照)的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为提取酶液总体积(mL) ；W为叶片鲜重(g)；以NBT光还原50%为单位。

1.3.2 POD活性的测定 用移液枪取20 μL的酶液，用移液管加入3 mL POD反应液，在470 nm下每隔1 min读一次数，共读数3次。

POD活性[ΔA470/(min·g)]=ΔA470×V/Va/W=ΔA470×5/0.02/0.5=ΔA470×500，式中A470为反应时间内OD 变化值。

1.3.3 CAT活性的测定 用移液枪取20 μL的酶液，用移液管加入2.5 mL CAT反应液，在240 nm下比色，每隔1 min读数1次，共读数3次。

CAT活性[ΔA240/(min·g)]= ΔA240×V/Va/W=ΔA240×200

1.3.4 丙二醛含量的测定 称取0.5 g剪碎的试材，用移液管吸取5 mL 10% TCA 溶液，研磨到匀浆，离心10 min。在2 mL上清液中加入2 mL 0.6% TBA 溶液，沸水浴加热15 min，然后再次离心，取上清液在532、450、600 nm 波长下比色。

MDA含量(μmol/g)=[6.45×(D532-D600)-0.56 D450]×0.015/W或[6.45×(D532-D600)-0.56 D450]×0.03/W。

1.3.5 脯氨酸含量的测定 将不同处理的黄芩叶片各采摘3 份，每份0.3 g，加入80%乙醇，研磨成匀浆，用 80%乙醇定容，在80 ℃水浴中加热20 min。称取材料0.3 g，加入5 mL磺基水杨酸，沸水浴 10 min，过滤，吸取滤液 2 mL加2 mL 冰醋酸和3 mL 酸性茚三酮，沸水浴 40 min，冷却，加入 5 mL甲苯，取上层溶液于比色皿中，在 520 nm 下比色。

脯氨酸含量(μg / g)=C×V/Va/W，其中C为脯氨酸浓度。

1.4 数据处理

测定不同处理各重复3次，实验数据为3次测定的平均值。采用Microsoft Excel 2007软件对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗过氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

由图1知，在处理4、8、12 d的黄芩叶片中，对照组(CK2)的SOD活性比CK1有所下降；在NaCl阈值(0.5%)胁迫下随着外源钙浓度的升高SOD 的活性都呈先上升后下降的趋势，在处理4 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5处理的SOD活性与对照(CK2)相比分别提高了4.8%、9.2%、9.2%、18%、6.4%。T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理的SOD活性达到最佳即200(吸光度/g)，是CK2的1.45倍，差异达显著水平(P<0.05)；在处理8 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5处理的SOD活性与对照( CK2)相比分别提高了14.7%、24.7%、31.5%、37.1%、33.3%。T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理的SOD 活性达到最佳即196(吸光度/g)，是CK2的2.18倍，差异达极显著水平(P<0.01)；在处理12 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5处理的SOD活性与对照(CK2)相比分别提高了14.1%、19.1%、32.4%、34.3%、15.7%。T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理的SOD 活性达到最佳即143(吸光度/g)，是CK2的2.17倍，差异达极显著水平(P<0.01)。由此可知，经过处理8 d的黄芩幼苗在T4处理下SOD的活性是对照组(CK2)的2.18倍，值为196(吸光度/g)，即T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理对盐胁迫下黄芩幼苗的缓解作用最为显著。

2.2 外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗过氧化物酶(POD) 活性的影响

由图2知，在处理4、8、12 d的黄芩叶片中，对照组(CK2)的POD活性比CK1有所下降；在 NaCl阈值(0.5%)胁迫下随着外源钙浓度的增加POD的活性都呈先上升后下降的趋势，在处理4 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的POD活性与对照(CK2)相比分别提高了17%、14%、28%、40%、12%，其中T4处理的POD活性达到最佳，即255 ΔA470/(min·g)，是CK2的232倍，差异达极显著水平(P<0.01)；在处理8 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的POD活性与对照(CK2) 相比分别提高了22%、38%、41%、48%、43%，T4处理的POD活性达到最佳即346 ΔA470/(min·g)，是CK2的2.88倍，差异达极显著水平(P<0.01)；在处理12 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的POD活性与对照(CK2)相比分别提高了16%、17%、21%、24%、17%，T4处理的POD活性达到最佳即148 ΔA470/(min·g)，是CK2的 1.64倍，差异达极显著水平(P<0.01)。同时在T4处理下，8 d的POD活性比4 d的POD活性高15%，比12 d的POD活性高40%，由此可知，经过处理8 d的黄芩幼苗在T4处理下POD的活性是对照组(CK2)的 2.88倍，值为346 ΔA470/(min·g)，即T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理能有效提高POD 活性。

图1 不同浓度外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗SOD活性的影响

图2 不同浓度外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗POD活性的影响

2.3 外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗中过氧化氢酶(CAT)活性的影响

由图3知，在处理4、8、12 d的黄芩叶片中，对照组(CK2)的CAT活性比CK1有所下降；在NaCl阈值(0.5%)胁迫下随着外源钙浓度的升高CAT的活性都呈先上升后下降的趋势，在处理4 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的CAT活性与对照(CK2)相比分别提高了22%、33%、54%、31%、25%，其中T3处理的CAT活性达到最佳即337 ΔA240/(min·g)；在处理8 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的CAT活性与对照(CK2)相比分别提高了7%、6%、36%、27%、31%，其中T3处理的CAT活性达到最佳即236ΔA240/(min·g)；在处理12 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的CAT活性与对照(CK2)相比分别提高了5%、23%、45%、21%、6%，T3处理的CAT活性达到最佳即257 ΔA240/(min·g)；同时在T3处理下4、8、12 d的CAT活性分别是 CK2的4.88倍、2.15倍、2.65倍，差异达极显著水平(P<0.01)。由此可知，经过处理4 d的黄芩幼苗在T3(0.6 mmol/L CaCl2)处理下CAT的活性达到峰值，值为337 ΔA240/(min·g)，即T3(0.6 mmol/L CaCl2)处理对盐胁迫黄芩幼苗的缓解作用最为显著。

图3 不同浓度外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗CAT活性的影响

2.4 外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗中丙二醛(MDA)含量的影响

由图4知，在处理4、8、12 d的黄芩叶片中对照组(CK2)的MDA含量比CK1明显有所上升；在NaCl阈值(0.5%)胁迫下随着外源钙浓度的升高MDA含量都呈下降的趋势。在处理4 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、 T5的MDA含量与对照(CK2)相比分别降低了26%、36%、55%、79%、78.9%；在处理8 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的MDA含量与对照(CK2) 相比分别下降了48.1%、33.3%、60.0%、63.0%、66.7%,其中T5处理的MDA含量最低即0.04 μmol/g，CK2是 T5的 5倍，差异达极显著水平(P<0.01)；在处理12 d的黄芩叶片中，T1、T2、T3、T4、T5的MDA含量与对照(CK2) 相比分别降低了8%、24%、31.3%、40%、61.5%。T5处理的MDA含量最低，为0.05 μmol/g，CK2是T5的4.2倍，差异达极显著水平(P<0.01)。由此可知，与对照组相比，随着CaCl2浓度的升高盐胁迫下黄芩幼苗中MDA含量呈下降趋势。

图4 不同浓度外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗MDA含量的影响

2.5 外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗中脯氨酸含量的影响

由图 5 可知，在处理4、8、12 d的黄芩叶片中，在NaCl阈值(0.5%)处理下随着钙离子浓度的增加脯氨酸含量都呈先上升后下降趋势。T4处理与对照组CK2相比，处理4 d的黄芩叶片中脯氨酸含量比CK2高46%，处理8 d的黄芩叶片中脯氨酸含量比CK2高37%，处理12 d的黄芩叶片中脯氨酸含量比CK2高21%，且分别是CK2的2.69、2.18、1.53倍。T4处理脯氨酸含量分别达0.043、0.074、0.061 μg/g，即在T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理下，脯氨酸含量达最大值0.074 μg/g。

图5 不同浓度外源钙对盐胁迫下黄芩幼苗脯氨酸含量的影响

3 讨论

SOD在生物体内的活性的高低是作物衰老和萎蔫的直观指标[12]；已有研究证实，SOD可以阻止氧自由基对细胞造成的损伤，能够很快修复受到伤害的细胞[13]。SOD在保持生物细胞内的活性氧代谢的稳定和保护植物细胞膜结构方面扮演着尤为重要的角色[14]。过氧化物酶(POD)是把H2O2当作电子受体从而来催化底物发生氧化作用的酶。在作物萌发生长过程中，不同阶段POD的活性不同。老化的组织部分POD活性比较高而才萌发的组织中它的活性比较低。所以过氧化物酶活性的高低可以作为表征植物组织衰老的一种指标[15]。本研究中，以NaCl阈值(0.5%)胁迫黄芩幼苗，喷施不同浓度的钙离子，通过测定黄芩叶片中SOD、POD、CAT的活性。发现黄芩幼苗中SOD、POD、CAT 活性呈先升后降趋势，其中SOD、POD、CAT活性均高于盐对照组(CK2)。由此说明不同浓度的外源钙具有提高盐胁迫下黄芩幼苗中SOD、POD、CAT活性的作用，其中POD、SOD活性在T4(0.8 mmol/L CaCl2)时达到峰值，POD活性为346 ΔA470/(min·g)，SOD活性为196(吸光度/g)；CAT活性在T3(0.6 mmol/L CaCl2)时达到峰值337 ΔA240/(min·g)。

在盐渍条件下，作物的细胞质膜受到损害，膜脂间发生过氧化作用的产物之一是丙二醛[16-18]。已有研究表明[19-20]：丙二醛(MDA)的含量可以通过添加一定浓度的外源钙而降低。丙二醛能够让膜的通透性加大的原理是其与膜蛋白产生交联反应，从而导致生物膜系统内很多保护酶的生理功能遭到破坏。所以可以用 MDA含量的多少来反映生物膜脂过氧化程度的强弱，以及作物受到损伤的程度。本研究中，在0.5% NaCl阈值(0.5%)胁迫下，经过不同浓度的外源钙处理后的黄芩幼苗中MDA含量均低于对照组(CK2)，这与尹大川等[21]的研究结果一致。说明一定浓度的钙离子通过降低MDA含量缓解细胞膜脂过氧化程度，从而缓解盐渍化条件对黄芩的损害。

已有研究报道[22-23]，植物在萎蔫的过程中脯氨酸的含量也非常高，脯氨酸作为细胞亲和溶质，它的含量可以影响渗透调节[24-26]。因此，脯氨酸是渗透调节物质，在盐胁迫作用下作物体内脯氨酸大量积累，调节细胞内外的渗透压，使细胞维持动态平衡[27-28]。本试验中，不同浓度外源钙处理中脯氨酸含量呈现先升后降趋势，即在T4(0.8 mmol/L CaCl2)处理下，脯氨酸含量达最大值0.074 μg/g。

综合以上结果，可以看出，一定浓度的外源钙处理盐胁迫下一年生黄芩幼苗，能有效提高SOD、POD、CAT活性和脯氨酸的积累量，降低丙二醛(MDA)含量，增强植株抗逆性，缓解盐胁迫伤害，其中在T4处理下即添加0.8 mmol/L CaCl2的缓解效果最佳。本研究结果能为黄芩的生产栽培和抗性育种研究提供一定参考和借鉴。黄芩属于多年生药用植物，但本试验仅选取了一年生黄芩幼苗开展了短时间的集中盆栽生理生化试验探索，要全面了解外源钙对黄芩盐胁迫伤害的缓解效应和作用机制，还有待结合大田生产实践在不同生育期开展生理和分子层面更深入研究。