低温浸渍对‘关口葡萄’干白葡萄酒风味物质的影响

朱艳霞，杨佳荟，王沙沙，苏颖玥，常 远，杨智刚，袁春龙*

（西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100）

葡萄原料与酿造工艺是决定葡萄酒品质的2 个重要因素。在发酵前采用不同的取汁方法，可以将同一批白葡萄制成具有明显不同口感特征的葡萄酒。澄清汁发酵是制作白葡萄酒最广泛的方法，也是干白葡萄酒传统酿造工艺。由于澄清汁发酵在酿造过程中，不需要进行浸渍，葡萄原料中的芳香物质很难进入到葡萄酒中，为提取葡萄原料中的芳香物质，酿酒师发明了冷浸工艺、超提工艺等。低温浸渍，也叫冷浸渍，是指在葡萄醪进入乙醇发酵之前，在一段时间范围内对其进行低于15 ℃的低温处理，以促进葡萄中色素、酚类以及挥发性香气物质的浸提作用，进而改善葡萄酒的品质[1]。目前采用低温浸渍工艺酿造干红葡萄酒已广泛应用于实际生产中，仅有部分优质干白葡萄酒采用低温浸渍技术，且对于低温浸渍对葡萄酒品质的影响以经验为主，因此研究低温浸渍对葡萄酒风味物质的影响具有重要意义。已有研究表明，低温浸渍处理可使薏斯琳干白葡萄酒香气成分复杂，质量优于传统酿造工艺[2]；6 ℃浸渍48 h后再发酵获得的“玫瑰香”葡萄酒颜色浅于桃红，果香浓郁，清新爽口，口感均衡，余味较长[3]。通过低温浸渍处理的Tannat和Merlot葡萄酒总多酚、花青素、原花青素含量显著增加[4]。通过研究低温浸渍对梅乐葡萄酒酚类和挥发性化合物含量的影响。结果表明，低温浸渍显著提高了酒中酚类化合物的含量，尤其是有助于葡萄酒颜色稳定的锦葵色素3-葡糖苷的含量增加，同时也增加了挥发性化合物的浓度，特别是酯类以及α-松油醇、香叶醇和2-苯基乙醇，使得具有梅乐典型风味的酯类含量增加超过20%[5]。通过采用传统酿造、低温浸渍以及浸渍发酵对樱桃酒的化学成分、挥发性、生物胺和感官特征的香气物质分析表明，低温浸渍促进了许多芳香族化合物的生产，包括酯类（己酸乙酯、丁酸乙酯）、醛类（苯甲醛）和萜烯（芳樟醇和β-大马酮），并增强了樱桃酒的果香，且低温浸渍在酿造樱桃酒中具有更大潜力[6]。但也有研究发现，低温浸渍会增加因酚类物质而带来的苦涩味和C6化合物引起的“生青味”，进而影响葡萄酒的口感与香气质量[7]。

‘关口葡萄’原产于湖北恩施建始县，该品种不仅果穗硕大、紧凑，且成熟后的整穗颗粒晶莹剔透，品种香气浓郁，因产于关口乡而得名。研究发现[8]，‘关口葡萄’属欧美杂交种，且果实中有含有较大的肉囊。随着栽培面积的扩大，仅靠鲜食已不能满足生产的需求，果酒酿造是可持续发展的首要选择。前期本课题组对‘关口葡萄’干白葡萄酒的不同加工工艺、多酚氧化酶特性比较及其研究进展进行了系统的研究，解决了酿造过程中出现的易氧化、难取汁等一系列加工难题[9-10]，很好地酿造出了符合该品种特色的干白葡萄酒，发挥其浓郁香气的优势，但在生产过程中存在风味物质表现不佳，如苦味强度较高等现象。为此本实验以清汁发酵工艺为对照（CK），采用发酵前低温浸渍技术进行‘关口葡萄’干白葡萄酒的生产，通过测定其基本理化指标、酚类物质、氨基酸类以及香气等风味物质含量以及感官评价，并分析‘关口葡萄’干白葡萄酒苦味强度与苦味化学组分含量之间的关系。旨在探究低温浸渍时间对‘关口葡萄’干白葡萄酒风味物质的影响，探寻其苦味物质的种类、含量，明确苦味的主要贡献物质，找出‘关口葡萄’干白葡萄酒适宜的酿造工艺，以期为合理开发和利用‘关口葡萄’资源提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘关口葡萄’（16 °Brix，pH 3.70，可滴定酸质量浓度7.30 g/L），采自湖北恩施建始县花坪镇关口乡。果胶酶（500 U/mg） 日本ROHAVIN Clear公司；乙腈（色谱纯） 美国Fisher公司；标准品水杨酸、香草酸、阿魏酸 美国Fluka公司；绿原酸、香豆素、香豆酸、咖啡酸、儿茶素、没食子酸、表儿茶素、丁香酸、香气标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外分光光度计、6890GC-5975MS气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；UPLC-Class超高压液相色谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒酿造

根据小容器酿造法[11]进行酿造，将筛选后的葡萄进行除梗破碎，装入玻璃发酵罐中，并添加60 mg/L（6% H2SO3）的SO2和30 mg/L的果胶酶。CK组直接压榨取汁，将自流汁与压榨汁混合后加入1 g/L的皂土，放置4 ℃下澄清24 h，分离后接种酵母200 mg/L，启动发酵，温度控制在（15f2）℃，发酵结束后调节游离SO2至30 mg/L左右，装瓶并贮存于冷库。

低温浸渍处理，将除梗破碎后的葡萄果实放入玻璃发酵罐后，于4 ℃分别放置12、24 h和48 h，后续发酵工艺与CK组一致。每组处理重复2 次。

1.3.2 酒样常规理化指标的测定

参照GB 15038ü2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及《葡萄酒分析检验》[12]方法分析测定葡萄酒中pH值、残糖、挥发酸（以乙酸计）、SO2以及乙醇体积分数等基本理化指标。所有指标均重复测定3 次，下同。

1.3.3 酚类物质测定

葡萄酒中总酚含量采用福林-肖卡[13]法测定，略有改动；总类黄酮含量采用苏鹏飞[14]的氯化铝比色法测定；总黄烷醇含量采用p-DMACA-盐酸法[15]测定；单体酚采用张星星等[16]的方法测定。

1.3.4 游离氨基酸含量的测定

参照芮鸿飞等[17]的方法，采用岛津氨基酸柱前衍生方法包测定。

1.3.5 香气成分分析

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱的方法[18]进行香气成分测定。

顶空固相微萃取操作步骤：1.00 g NaCl、5 mL葡萄酒样品或标准品溶液于15 mL样品瓶中，加入磁力搅拌子、4-甲基-2-戊醇溶液后，加热搅拌30 min，然后将已活化萃取头插入样品瓶的顶空部分，40 ℃吸附30 min，立即在气相色谱进样口250 ℃条件下解吸8 min。每个样品重复萃取2 次。

气相色谱条件：载气为高纯度氦气（99.999%），流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流；升温程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；电离能量70 eV；四极杆温度150 ℃；质谱接口温度280 ℃；质量扫描范围30～350 u。

定性定量方法：采用与香气标准品的物质保留时间和质谱信息对比、文献报道中相似色谱条件下该化合保留指数以及NIST 05标准谱库NIST Chemis比对结果进行半定性分析，采用内标-标准曲线法定量，具体方法参照刘迪等[19]方法。

1.3.6 感官分析

感官品尝小组成员由15 名接受过专业感官培训的学生组成。评价小组分别从外观（15 分，其中颜色10 分、澄清度5 分）、香气（30 分，其中纯正度6 分、浓郁度8分、质量16 分）、口感（44 分，其中纯正度6 分、浓度8分、持久性8 分、质量22 分）以及整体平衡性（11 分）4 个方面对葡萄酒进行比较品尝，总分为100 分[9]。

1.3.7 苦味量化与培训

参照Gawel等[20]的方法。首先对感官品尝小组进行0.1 g/L硫酸奎宁溶液训练识别苦味[21]。利用线性标记法，对质量浓度梯度为0、3、6、9、12、15 mg/L的硫酸奎宁标准溶液进行反复线性定位，确定苦味强度在直线上大致的位置。对酒样进行苦味定量分析时，以标准溶液为参照，确定其苦味强度。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0统计软件，运用相关性分析和单因素方差分析对所测的数据进行分析，从中得出低温浸渍对‘关口葡萄’干白葡萄酒品质的影响。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）进行不同处理试样酒中香气成分与感官总分影响的研究，分析其中香气物质气味活性值（odor active value，OAV），按下式计算。使用Unscrambler 10.1（CAMO，Oslo，Norway）进行偏最小二乘回归分析，评估苦味物质对苦味强的贡献，所有数据处理前需进行标准化处理。为了减少偏最小二乘回归时因多变量带来的误差，仅选取与苦味强度呈显著相关（P＜0.05）的物质进行偏最小二乘回归分析。最终根据Jack-knife不确定度的分析计算得到估计回归系数，以此考察酒中苦味强度呈显著相关的苦味物质。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒常规理化指标分析

表1 浸渍时间对‘关口葡萄’干白葡萄酒理化指标的影响Table 1 Physicochemical properties of wines with different PCM times

如表1所示，与CK相比，低温浸渍会使葡萄酒可滴定酸含量显著降低，这与相关研究一致[22]；通过测定酒样中的挥发酸含量，可以了解葡萄是否生病及病害的严重程度，不同处理间差异较小，说明低温浸渍处理与CK相同，均能使乙醇的发酵过程正常进行；通过对比不同处理SO2含量发现，低温浸渍使SO2显著升高，表明低温浸渍处理可能会抑制微生物活动或者降低多酚氧化酶的活性，从而抑制酚类物质的氧化，减少SO2的消耗量。值得注意的是，随着浸渍时间的延长，pH值逐渐升高，主要是由于在浸渍过程中缓冲离子的释放所引起的。

2.2 葡萄酒酚类物质分析

图1 ‘关口葡萄’干白葡萄酒中酚类物质（A）和苦味单体酚（B）含量Fig. 1 Contents of polyphenols (A) and bitter monophenols (B) in wines

酚类化合物是衡量葡萄酒质量的重要参数，酚类物质作为一大类复杂的具有抗氧化性的物质，主要参与形成葡萄酒的味道、骨架、结构和颜色等。研究发现[23]，在白葡萄酒中，酚类物质的浓度远超过其感官阈值，能够增加酒体的丰满度与其抗氧化活性，但过量的酚类物质也会破坏其整体的平衡性。Hernanz等[24]研究发现酚类物质还可以改变白葡萄酒的挥发性成分，进而影响葡萄酒的质量。由图1A可知，与传统发酵相比，低温浸渍工艺使酒样中酚类物质的溶解受到一定限制，但随着浸渍时间延长，酚类物质含量随之增加，进而提高葡萄酒本身颜色的稳定性。这种现象是由于在果皮浸渍、乙醇发酵的过程中，位于果皮、果籽中的酚类物质通过浸提的作用转移到葡萄酒中。

在葡萄酒中共检测出12 种主要单体酚，其中类黄酮包括1 种黄烷醇类与3 种黄酮醇类，黄烷醇类中仅检测到儿茶素一种物质，3 种黄酮醇分别为槲皮素、芦丁、山柰酚，非类黄酮包括3 种羟基苯甲酸和5 种羟基肉桂酸，羟基苯甲酸为没食子酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸，羟基肉桂酸为阿魏酸、绿原酸以及香豆素。由图1B可知，低温浸渍技术使儿茶素含量增加，且随着浸渍时间的延长，儿茶素含量显著增加；在黄酮醇类中仅槲皮素物质的质量浓度有一定程度的增加，其余2 种差异不显著（P＞0.05）；非类黄酮中，没食子酸、咖啡酸、丁香酸含量受低温浸渍影响显著（P＜0.05）。总体说明，低温浸渍技术能够一定程度增加‘关口葡萄’干白葡萄酒中单体酚类物质含量，且随着浸渍时间的延长，单体酚类，特别是儿茶素、没食子酸、咖啡酸以及丁香酸含量显著增加（P＜0.05）。

2.3 葡萄酒氨基酸含量分析

图2 ‘关口葡萄’干白葡萄酒中氨基酸含量Fig. 2 Amino acid contents in wines

氨基酸具有甜、酸、苦、鲜4 种不同的味感，游离氨基酸的含量及种类对葡萄酒口感有较大的影响[25-26]。由图2可知，‘关口葡萄’干白葡萄酒中共检测出7 种苦味氨基酸（组氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸）、2 种酸味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）以及4 种甜味氨基酸（甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸）[27]。与CK相比，低温浸渍会显著增加‘关口葡萄’干白葡萄酒中苦味氨基酸含量，减少甜味氨基酸的含量，而酸味氨基酸含量总量无显著差异，从而会一定程度的增加‘关口葡萄’干白葡萄酒的苦味强度；且随着浸渍时间的延长趋势更加明显。

2.4 葡萄酒香气物质分析

图3 ‘关口葡萄’干白葡萄酒中香气物质含量Fig. 3 Contents of aroma compounds in wines

表2 ‘关口葡萄’干白葡萄酒中香气成分Table 2 Quantitative analysis of aroma compounds in wines

续表2

‘关口葡萄’干白葡萄酒共检测到51 种香气成分，主要香气成分是酯类、高级醇类、脂肪酸类以及萜类、羰基化合物类等微量化合物。与传统酿造相比，低温浸渍技术会使‘关口葡萄’干白葡萄酒香气物质总含量降低，且随着浸渍时间的延长，香气含量显著降低（P＜0.05），研究结果与Alexicandre等[28]相同。所酿‘关口葡萄’干白葡萄酒中均有16 种香气成分OAV大于1，但部分香气成分OAV差异显著。

醇类物质通常赋予葡萄酒强烈的化学气味，辛辣味以及草本气味，但随着其在葡萄酒中组成和含量的不同，葡萄酒可能具有怡人的果香、花香以及蜂蜜气味等。相关研究发现，对葡萄酒香气有贡献的高级醇为丁醇、异丁醇、己醇、戊醇、苯甲醇、苯乙醇与乙烯醇[29]。

由图3、表2可知，由低温浸渍工艺酿造的葡萄酒高级醇总量显著高于CK，高级醇总量在浸渍W1酒样中最高，其次为W2、W3。在高级醇中，正己醇与苯乙醇OAV均大于1，对‘关口葡萄’干白葡萄酒香气贡献较大，由表2可知，低温浸渍会降低对葡萄酒香气有贡献的正己醇与苯乙醇含量。Rapp等[30]指出高级醇质量浓度低于400 mg/L会促进葡萄酒香气和口感，在本实验中不同浸渍时间的葡萄酒中高级醇质量浓度均低于400 mg/L，其中对葡萄酒香气有显著贡献的苯乙醇主要表现为花香、蜂蜜等；正己醇对葡萄酒香气产生青香等负面影响，低温浸渍显著降低正己醇含量，有利于葡萄酒香气的表现。

酯类是葡萄酒中重要的香气成分，一般赋予葡萄酒果香与花香。低温浸渍工艺会显著影响葡萄酒中酯类物质的总量，在‘关口葡萄’干白葡萄酒中，共有7 种酯类化合物对葡萄酒香气有贡献，分别为丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯。其中低温浸渍会增加OAV较高的己酸乙酯和癸酸乙酯的含量，且随着浸渍时间的延长呈上升趋势；丁酸乙酯、乙酸异戊酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯总量显著减少，且随着浸渍时间的延长呈降低趋势；而辛酸乙酯的含量，W1显著的高于CK，W2、W3显著低于CK。

葡萄酒中一些脂肪酸和有机酸通常是有酵母菌与乳酸菌在乙醇发酵与苹果酸-乳酸发酵过程中产生的。与CK相比，经低温浸渍处理的葡萄酒中酸类物质的含量显著降低。在脂肪酸类物质中，除乙酸外，其余物质OAV均大于1，对葡萄酒香气贡献较大。在脂肪酸类物质中通常会给葡萄酒本身带来一定的腐臭或类似黄油、油脂等负面香气，低温浸渍技术减少了干白葡萄酒中脂肪酸类物质的含量，进而减少葡萄酒因脂肪酸带来的不良风味。

葡萄酒中大约存在50多种萜烯类物质，他们广泛存在于葡萄果皮与葡萄果肉细胞中，尤其是麝香葡萄品种，一般赋予葡萄酒以花香和果香等感官特征。如表2所示，‘关口葡萄’干白葡萄酒中共检测到6 种萜烯类物质，包括β-月桂烯、芳樟醇、α-松油醇、脱氢芳樟醇、香茅醇、β-大马酮。与CK相比，低温浸渍技术使葡萄酒中的萜烯类物质的含量显著升高（P＜0.05），且随着浸渍时间的延长，萜烯类物质总量呈升高趋势。

此外，还检测到壬醛、癸醛、苯乙酮以及苯乙烯4 种香气化合物。其中壬醛、癸醛属于低级脂肪醛类化合物，在高度稀释下具有良好的香气。表2显示，W1中壬醛的含量显著高于CK，且随浸渍时间的延长逐渐减少，但与CK差异不显著；癸醛在W2中含量最高，但与CK无显著性差异，且2 种物质的OAV均大于1。苯乙酮为脂肪酮类化合物，在CK中苯乙酮含量最低，低温浸渍使其含量显著增加，并随着浸渍时间的延长显著上升。苯乙烯为芳香烃类香气物质，其含量在CK组最高，低温浸渍会使其含量显著降低，时间越长降低越多。这些化合物也会随其在葡萄酒中含量的不同而对葡萄酒香气产生积极或者负面的影响。

2.5 葡萄酒感官品质分析

图4 ‘关口葡萄’干白葡萄酒感官分析图Fig. 4 Analysis of sensory quality of wines

从图4可以看出，与CK相比低温浸渍可以增加葡萄酒的澄清度、颜色、口感纯正度、口感浓度、口感持久性、口感质量、整体平衡性、整体评分以及苦味强度，但香气的纯正度、浓度以及质量降低。其中W2葡萄酒的澄清度、颜口感持久性、口感纯正度以及整体评分最高，W3的口感浓度和整体平衡性最高但整体评分有所下降，因此适当的低温浸渍技术可提高干白葡萄酒的整体品质质量。值得注意得是，在‘关口葡萄’干白葡萄酒中，随着低温浸渍时间的延长显著增加了本身的苦味强度。

图5 前2 个主成分上的香气、口感质量与酒样分布Fig. 5 Loading plot of PC1 versus PC2 for sensory quality of wine samples

由图5可知，与CK相比，W1整体评分差异较小，W2整体评分较高，W3酒样中焦糖、青苹果、苦杏仁、甘草、黑咖啡的气味增加，进而影响酒样的整体感官质量。低温浸渍会使干白葡萄酒的香气质量由果香等品种香气转化为蜂蜜、青苹果等特征香气，但随着浸渍时间的延长也会使甘草以及苦杏仁味增加，从而影响干白葡萄酒品质。

2.6 葡萄酒苦味相关物质分析

葡萄酒中的苦味主要源于加工过程中的葡萄皮、葡萄籽以及葡萄梗，较低的苦涩味可以增加葡萄酒酒体的复杂性，但是过重的苦涩味会严重影响葡萄酒自身的质量。由图6可知，与CK相比，低温浸渍W2、W3的苦味强度显著高于CK，但是W1的酒样苦味强度有所增高但与CK差异不显著。

图6 浸渍时间对‘关口葡萄’干白葡萄酒的苦味强度的影响Fig. 6 Effect of PCM time on bitter intensity of wine

图7 ‘关口葡萄’干白葡萄酒的偏最小二乘回归分析图Fig. 7 Partial least squares regression analysis of bitterness intensity of wine

如图7a所示，均方根预测误差为0.133，R2为0.976，模型较好。该模型中，除山柰酚外，所有自变量均与苦味强度呈正相关，这些化学组分对苦味的贡献度如图7b所示。在酚类物质中，对‘关口葡萄’干白葡萄酒苦味强度影响较大的为总类黄酮物质，此结果在其他食品中也有发现[44]。相关研究表明[45-46]，总酚对白葡萄酒的苦味影响较小或者无关，与本实验研究一致。值得注意得是，本实验中黄烷醇与苦味强度贡献度较小，此结果与Soares等[47]研究一致，与Narukawa等[48]相反。黄烷醇与苦味强度贡献度较小，这可能是由于在酒样酿造过程中，为提高出汁率而进行的果皮浸渍以及果胶酶的添加，使得糖、酸对黄烷醇的掩蔽作用引起的。在单体酚类物质中，儿茶素、槲皮素、咖啡酸、丁香酸、香豆酸以及阿魏酸均对酒样苦味强度影响较大；在苦味氨基酸中，仅有组氨酸和精氨酸对酒样苦味影响较大，主要是由于苦味氨基酸阈值较大，使得苦味氨基酸对苦味强度的贡献较小。

3 结 论

本研究以湖北恩施‘关口葡萄’为原料，发酵前4 ℃分别浸渍12、24 h和48 h。通过低温浸渍工艺对‘关口葡萄’干白葡萄酒酿酒特性研究发现，与传统工艺相比，经低温浸渍处理酿造的‘关口葡萄’干白葡萄酒中酚类物质、氨基酸总量均增加，香气物质总量减少，但使具有品种香气的萜烯类化合物含量显著增加。其中，低温浸渍导致其香气总量降低的根本原因有待进一步研究。

PCA和感官评定结果表明，低温浸渍能够改善‘关口葡萄’干白葡萄酒的品质。其中低温浸渍12 h时酒样感官评分与CK差异较小，低温浸渍24 h所酿酒样的感官评分最高，低温浸渍48 h酒样因苦杏仁、甘草、黑咖啡等香气的增加使感官评分有所下降。

值得注意得是，低温浸渍工艺对酒样的苦味影响较大，特别是随着浸渍时间的延长，苦味强度明显增加。偏最小二乘回归分析发现：对苦味影响较大的物质有类黄酮、单体酚（山柰酚除外）、组氨酸以及精氨酸。因此应进一步确定此苦味物质在‘关口葡萄’中的主要分布部位，为酿造过程中合理控制苦味强度，促进‘关口葡萄’深加工提供部分理论基础。