补肾益智颗粒中8种黄酮类成分的含量测定*

薛 傲，孙慧峰，徐 姣，姚 远，张 宁

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）[1]是老年痴呆症的主要表现形式，是最常见的中枢神经系统退行性疾病，主要表现为渐进性认知功能障碍和行为障碍。目前，大多数治疗AD药物为美金刚、非甾体类抗炎药物、乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂等，但是这些药物疗效有限，且具有严重的不良反应。中医认为肾为先天之本，补肾生髓充脑是中药治疗AD的重要方法[2,3]。骨碎补是传统补肾中药，研究表明骨碎补总黄酮中柚皮苷、新北美圣草苷、木犀草素等成分对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有明显的药理保护作用[4]；顾婷从动物实验水平上探讨了骨碎补总黄酮提取物对APP/PS1双转基因AD模型小鼠学习记忆能力的保护作用及作用机制，结果显示骨碎补总黄酮能够明显改善小鼠学习记忆障碍[5-9]。大量动物、细胞等药效药理实验表明骨碎补总黄酮成分具有良好的抗AD作用。故本实验室以骨碎补总黄酮为有效成分开发的治疗AD创新药物补肾益智颗粒。其中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚为骨碎补总黄酮中主要有效成分且药理作用良好。因此，选择新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等8种黄酮类成分为补肾益智颗粒质控指标成分进行含量测定研究。

目前，黄酮类成分含量测定的主要方法有紫外分光光度法、HPLC-UV、UPLC等[10]，超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-TQD-MS）联用仪具有分析速度快，分离度高，灵敏度高等特点，广泛应用于中草药复杂组分的分析及含量测定[11,12]。故本文采用UPLC-TQD-MS法测定补肾益智颗粒中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等8种黄酮类成分含量，该方法简便快捷，为该类产品的质量控制及其后续临床给药研究奠定基础。

1 仪器与材料

ACQUITY UPLCTM系统；WatersRMicromassRQuattro PremierTMXE三重四级杆串联质谱仪（Waters Corp.,Milford，MA，USA）；电子天平（瑞士，METTLER TOLEDO）；KQ-250DB型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯 美国Fisher公司）；醋酸、甲醇试剂等为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；水（娃哈哈纯净水杭州娃哈哈集团有限公司）；补肾益智颗粒（实验室研发自制中试阶段）；对照品木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（FB-02004）购自上海永恒生物科技有限公司；对照品紫云英苷（MUST-14120515）、木犀草素（MUST-15021005）、柚皮素（MUST-15050416）和山奈酚（MUST-14110508）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；对照品柚皮苷（L750N46）（北京百灵威科技有限公司）；新北美圣草苷（13214-32-2）（上海田源生物技术有限公司）；对照品圣草酚（HE126422198）（宝鸡市辰光科技有限公司）；以上对照品含量≥98%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与质谱条件

ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（2.1×100mm，1.7μm）；流动相 1%醋酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0～3min，30%B；3～4.5min，30%～40%B；4.5～6min，40%～70%B；6～7min，70%～90%B），流速 0.25mL·min-1，进样量5μL，柱温35℃。质谱条件：正离子检测模式，采用电喷雾电离源（ESI），扫描方式为多反应离子监测模式（MRM），各化合物的质谱信息见表1。干燥气流速10L·min-1，干燥气温度300℃，雾化气压力45psi（1psi=6.895kPa），毛细管电压4kV。

表1 8种黄酮类成分的多反应监测模式信息Tab.1 Multi-response monitoring model information of eight flavonoid components

2.2 对照品溶液的制备

取适量新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚对照品，精密称定，加甲醇分别制成浓度为 1，0.2，0.2，1，0.2，0.2，0.6，0.2mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取补肾益智颗粒样品，研细，精密称取约0.05g，置于烧瓶中，精密加入25mL甲醇，超声处理30min，放冷后称定质量，并用甲醇补足减失质量，摇匀后过滤，取适量滤液过0.22μm滤膜，即得。

2.4 线性范围

分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液分别稀释至原浓度的 1，10，100，1000，10000，100000 倍，按“2.1”项下色谱、质谱条件进行测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，得新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的回归方程及线性范围。结果见表2。

表2 各被测成分的标准曲线方程、线性范围和相关系数Tab.2 Standard curve equations，linear ranges and correlation coefficients for each measured component

2.5 精密度考察

取补肾益智颗粒适量，按“2.3”项下制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下测定新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的峰面积，其RSD（n=6）分别为 2.06%、1.42%、1.61%、0.68%、1.95%、1.43%、2.72%、1.62%，符合要求。

2.6 重复性试验

取补肾益智颗粒约5mg，6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，注入液相色谱-质谱联用仪，分别进行测定，计算含量。6份供试品溶液中中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.68%、1.84%、1.62%、1.43%、1.32%、0.82%、1.26%、2.08%，结果表明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取样品约50mg，精密称定，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，分别于室温下放置 0，2，5，10，16，24h，吸取供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件质谱条件进行测定，新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的峰面积RSD（n=6）分别为1.36%、1.72%、2.08%、1.83%、2.47%、1.58%、2.56%、2.43%符合要求，表明供试品溶液在室温状态下24h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取样品约50mg，6份，精密称定，分别精密加入对照品适量，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，在上述色谱及质谱条件下进行测定，计算平均加样回收率，平均加样回收率分别为100.08%（RSD=1.17%）、100.81%（RS D=2.87%）、103.69%（RSD=1.75%）、100.58%（RSD=0.92%）、100.37%（RSD=2.66%）、93.18%（RSD=1.87%）、98.75%（RSD=1.07%）、93.40%（RSD=2.46%），结果表明回收率较稳定且较高，符合本试验要求，结果见表3。

2.9 含量测定

取不同批次补肾益智颗粒，按“2.3”项下制备成供试品溶液后，按“2.1”项下色谱条件质谱条件进行测定，将色谱峰面积代入回归方程得到骨碎补中新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚的含量，结果见表4。

表4 不同批次补肾益智颗粒中8种成分含量（mg·g-1）Tab.4 Contents of eight components in different batches ofBushenYizhi granules（mg·g-1）

3 结果与讨论

3.1 提取方式的选择

根据预实验，分别对不同溶剂（水、70%甲醇、甲醇）、提取方式（超声和回流）及提取时间（15，30，45min）等几个方面进行考察，最终确定甲醇是提取骨碎补黄酮类成分的最佳溶剂,最佳提取方式为甲醇超声30min。

3.2 色谱条件的选择

同时对流动相（乙腈-水，醋酸-水和乙腈-不同浓度的甲酸水）、柱温（35，45℃）、流速（0.25，0.35mL·min-1）等方面进行了考察，结果表明流动相选择乙腈-1%醋酸水色谱峰峰型较好，分离效果较好；确定色谱条件为流动相1%醋酸水（A）-乙腈（B），流速0.25mL·min-1，柱温35℃。

3.3 质谱条件的选择

分别对质谱条件下正、负离子检测模式，离子喷雾电压，离子源温度，锥孔电压（DP），碰撞能量（CE）等方面进行考察。发现正离子检测模式峰强较好，满足检测要求；离子源温度为300℃；离子喷雾电压为3.5kv；锥孔电压及碰撞能量见表1。

3.4 含量测定指标及检测方法的选择

以往骨碎补含量测定研究主要运用HPLC测定新北美圣草苷和柚皮苷两种黄酮类成分或仅以骨碎补中柚皮苷作为含量测定指标[13,14]；《中国药典》2015版一部收载的骨碎补含量测定的成分为柚皮苷。骨碎补总黄酮中主要成分为新北美圣草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、柚皮素、山奈酚等8种成分，且药理活性良好，故选择其为补肾益智颗粒质控指标成分进行含量测定。预实验中曾尝试运用高效液相色谱法测定补肾益智颗粒中质控指标成分含量，但发现存在成分之间相互干扰严重，分析时间较长且分离度较差，不符合含量测定方法简单、有效、快速等原则，故选用UPLC-TQD-MS[15]法补肾益智颗粒进行含量测定，因其具有高选择性、高灵敏度，分析速度更快等特点，并且选用三重四级杆质谱的MRM（多通道离子检测）模式下检测，可以排除背景干扰。

4 结论

本研究首次采用UPLC-TQD-MS法MRM模式下测定补肾益智颗粒中黄酮类成分可在7min中内同时检测到8种黄酮类成分含量，该法简单，方便易于操作且具有灵敏度高、重复性好、分离效果明显等特点。能够更全面地控制补肾益智颗粒的质量，且方法稳定可靠，简便易行，为完善该制剂的质量标准提供了新的依据，同时可作为骨碎补药材质量控制的进一步补充。