白屈菜炮制方法的初步研究

2020-03-11丁原全李瑞海贾天柱

化学工程师 2020年2期

丁原全，李瑞海，贾天柱

（1.联勤保障部队大连康复疗养中心付家庄医院，辽宁大连 116001；2.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600）

2020版药典关于白屈菜的记载，缺少白屈菜的饮片项目，这样不利于在市场上应用白屈菜这味具有良好疗效的传统中药。本实验室课题研究内容主要是为增加2020版药典白屈菜饮片的质量标准。在研究中发现，白屈菜在临床中其饮片除了净制的简单方法以外，别无其他炮制内容。但临床应用的过程当中，发现白屈菜的炮制是有必要的。白屈菜具有止痛的作用，中医理论认为醋制后能够引药归肝经，并增强止痛的作用。同时，现代研究表明，白屈菜当中含有大量的生物碱，那么是不是在经过炮制以后，能够更好的发挥白屈菜当中生物碱类成分的作用，有待于进一步的研究。本研究主要的内容是利用不同的醋制方法，对白屈菜炮制条件进行初步研究，为白屈菜的饮片进一步炮制研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

吉林产白屈菜，经辽宁中医药大学药学院王荣祥教授鉴定为罂粟科植物白屈菜（Chelidonium majus L.）的干燥全草；米醋（厨邦9度米醋，广东美味调味食品有限公司）、Chelidonine（YZ180424）（南京源植物生物科技有限公司）、Chelerythrine（20170103）、Berberine（20160907、Sanguinarine（20140717）、）Coptisine hydrochloride（20170719）和 Protopine（201706 12）（由大连美仑生物技术有限公司提供）；盐酸等试剂均为分析纯（国药集团公司）。

1.2 仪器

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；安捷伦色谱工作站；SF-130B型高速粉碎机（上海冠联制药装备有限公司）；AS3120型超声提取器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；十万分之一电子天平（CP225D，SARTORIUS）；RE5ZCS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 对照品溶液的制备

分别取 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine和 Chelerythrine等对照品加甲醇配制成 0.0160、0.0512、0.0431、0.0218、0.0113和0.0162mg·mL-1的对照品溶液备用。

1.4 供试品溶液的制备

取本品粉末（过三号筛）约2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加盐酸-甲醇（0.5∶100）混合溶液40mL，称定重量，加热回流1.5h，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇（0.5∶100）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20mL，蒸干，残渣加50%甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[2]。

1.5 色谱条件[6]

色谱柱为中汇达Kromasil分析柱（4.6×250mm，5μm）；流动相：0.1%三乙胺（用H3PO4调节pH 值至3.0）-乙腈；梯度洗脱条件，0～18min24%，32min35%检测波长为274nm；流速为 1mL·min-1；柱温35℃；进样量为20μL。

2 结果与讨论

2.1 专属性实验[7]

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，在上述选定的色谱条件下进行测定，结果对照品的分离度良好，且与供试品中的其它成分不干扰。

图1 对照品（A）、白屈菜药材（B）的HPLC图Fig.1 HPLC of reference（A）and Chelidonium（B）

2.2 标准曲线的绘制

精密吸取 Protopine 0.80mg·mL-1、Chelidonine 1.28mg·mL-1、Coptisine hydrochloride 1.0775mg·mL-1、Sanguinarine 0.545mg·mL-1、Berberine 0.2825mg·mL-1和 Chelerythrine 0.405mg·mL-1的混合对照品 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0mL，置于 25mL 量瓶中以甲醇定容，按“1.5项”下的色谱条件，注入液相色谱器仪中，测定色谱峰面积，以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标Y，绘制标准曲线，回归方程及线性范围见表1。

表1 对照品的进样量和峰面积相关表Tab.1 Sample quantity and peak area of reference substan ce related list

结果表明 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine对照品，具有良好的线性关系。

2.3 精密度试验

精密吸取6种对照品，测定，测得Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine和Chelerythrine对照品的峰面积 RSD（n=6）分别是1.04%、1.02%、1.14%、0.66%、1.20%、0.55%，说明方法精密度良好。

2.4 重复性试验

取样品，按“1.4项”和“1.5项”下方法制备和HPLC 测定，结果 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine对照品的峰面积 RSD（n=6）分别为 0.51、4.77、4.71、1.30、0.35 和 1.01mg·g-1，说明方法重现性良好。

2.5 稳定性试验

取供试品，按“1.5 项”下色谱条件，于 0，2，4，8，12，24h 进样测定，结果 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine对照品的峰面积RSD（n=6）分别为1.59%、1.85%、0.63%、1.04%、0.80%、0.92%，表明样品在24h内稳定。

2.6 加样回收试验

取样品粉末6份，每份2g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入 Protopine 1.01mg·mL-1、Chelidonine 9.71mg·mL-1、Coptisine hydrochloride 9.51mg·mL-1、Sanguinarine 2.58mg·mL-1、Berberine 0.70mg·mL-1和Chelerythrine 2.04mg·mL-1混合对照品溶液 10mL，按“1.4项”和“1.5项”下方法制备和HPLC测定，计算回收率，结果 RSD（n=6）分别是 2.43%、2.36%、2.29%、2.30%、2.04%和1.82%，符舍相关规定。

2.7 样品炮制和测定结果

2.7.1 分别取白屈菜500g，加入纯米醋100g拌匀，分成5份，每份100g，按下述方法处理。炙法，用文火加热炒干，备用。烘法，烘箱干燥，备用。蒸法，置于蒸笼中加热蒸20min，取出，将白屈菜用锅底蒸馏水拌均，烘箱干燥，备用。煮法，将白屈菜置锅中加入适量清水200g，用文火煮20min，烘箱干燥，备用。焖法，将白屈菜置锅中，焖20min，取出烘箱干燥，备用。

2.7.2 将生品和醋焖法的白屈菜，各100g，加水没过药（200mL），浸泡 20min，先武火后文火，煎煮两次，合并药液，浓缩至稠膏，烘至干，各精密称取0.5g，备用。

2.7.3 取上述样品，按“1.4项”和“1.5项”下方法制备和HPLC测定，结果见表2。

表 2 样品测定结果（mg·g-1，n=3）Tab.2 Samples determination results（mg·g-1）

2.8 小结与讨论

（1）各样品原阿片碱、白屈菜碱、盐酸黄连碱、血根碱、小檗碱和白屈菜红碱含量测定结果见表2，从结果中看到，焖法相对于其它的炮制方法，所含总碱量最高。所有的醋制品的6种成分无论是单一的含量还是总量均低于生品，说明炮制过程对白屈菜的成分是有影响的。说明在炮制的过程当中，由于条件控制不好，会使得一些水溶性碱性成分损失，比如在炮制过程中在加醋润湿的过程当中，水溶性的生物碱类的成分会粘在容器的表面而损失掉，这样的损失由于量是固定的，因此，可以在工业生产的时候而相对减少。其中焖法和烘法结果发现，无论是总成分还是各自的成分来说减少得不多，并都符合药典的要求。

（2）不容忽视的是汤剂是中药临床使用非常广泛和常见的剂型。因此，本实验还进行了生品和醋制品汤剂提取效果差别的研究。结果见表2，实验结果发现，利用焖制法进行处置的白屈菜在进行汤剂煎煮的过程当中，其提取率是非常高的，而生品在汤剂煎煮的过程当中，提取率则非常低。从这一点可以看出，白屈菜的醋制还是非常必要的。因为其很多碱性成分是原小檗碱类的生物碱为叔胺型以游离的形式存在，是不溶于水的。因此，在经过醋制以后，使得其转变为季胺型增加了水溶性，促进了其有效成分的溶出。因此，在饮片的过程当中，通过本研究结果表明，白屈菜的饮片炮制过程还是非常有必要的。为初步研究的过程，具体的关于醋的用量，焖煮时间等参数尚需进一步的研究。