高羊茅硝态氮转运蛋白基因NRT1.1的克隆及表达模式分析

赵丽丽 王小利 陈 超 董 瑞

(1贵州大学动物科学学院草业科学系,贵州 贵阳 550025;2贵州省农业科学院草业研究所,贵州 贵阳 550006)

氮(N)是植物生长和发育中最重要的营养元素之一,也是植物细胞中蛋白质、核酸、酶、叶绿素等物质的主要组成成分,其可占植物干物质总量的1%～5%[1]。世界范围内的耕作土壤普遍存在氮素缺乏的现象,而外施氮肥是提高作物产量的主要农艺措施之一[2]。氮肥对作物产量的贡献约为45%[3]。研究表明,适量的氮可增强作物的耐盐性[4]。而过量施用氮肥,由于氮未被植物完全吸收利用,会造成硝酸盐积累,引起土壤、水和空气的氮污染,导致农产品品质、抗病虫和抗倒伏能力降低[5-6]。程慧煌等[7]研究表明,过量施用氮肥会增加杂交水稻的倒伏率。据统计,目前我国氮肥年施用量已达2 500 万t,是世界平均水平的3 倍,但氮肥利用效率(nitrogen utilization efficiency,NUE)较低,仅30%左右[8]。因此,提高氮肥利用率,减少氮肥施用对保护生态环境和农业的可持续生产具有重要意义。

在自然界中,硝酸盐(NO3-)是影响植物生长、发育和应激反应的主要因素。因此,硝酸盐信号传导和调节是植物响应环境信号的核心因素[9]。植物可以同时利用土壤中的无机氮和有机氮,其中硝酸盐是大多数作物吸收和利用的主要形式[10]。但土壤中NO3-浓度在时间和空间上通常剧烈波动,已成为限制作物生长和产量提高的主要因素之一[11]。植物能够根据自身内部氮含量和外部NO3-有效性的变化快速调节对NO3-的获取效率[12]。尤其是整株植物在低氮状态下会导致根中NO3-吸收系统的快速上调,并刺激根系生长以改善对土壤中氮的吸收效率[13]。硝态氮转运蛋白(nitrate transporters,NRTs)包括NRT1 和NRT2两个硝酸盐转运蛋白家族,其主要功能是负责植物根系对NO3-的吸收和转运[14]。其中NRT1 转运蛋白家族参与低亲和力转运系统(low affinity transport system,LATS),NRT2 转运蛋白家族参与高亲和力转运系统(high affinity transport system,HATS)[15-16]。NRT 家族对硝态氮的亲和性会影响植物对硝态氮的吸收能力[17]。前人在高等植物中已经发现NRT1 和NRT2 硝酸盐转运蛋白基因家族有多个亚型。如,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已经鉴定出8 个NRT1和7 个NRT2 的基因亚型[18];在水稻(Oryza sativa)中,已经报道的NRT基因达100 多个,且多数为NRT1 家族蛋白[14]。

高羊茅(Festuca arundinacea)为禾本科多年生植物,是温带地区广泛种植的冷季型草坪草和牧草[19]。目前,已有关于高羊茅吸收利用氮素的生理特性以及氮胁迫下的蛋白组学的研究报道[20-21],但关于氮吸收转运蛋白家族NRT1 和NRT2 对高羊茅耐低氮机理的研究尚鲜见报道。本研究利用 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了高羊茅NRT1.1 基因全长,并对其编码蛋白的序列特征及在不同胁迫下的表达模式进行分析,旨在为高羊茅耐低氮相关基因的功能和机理研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以贵州省草业研究所育成的黔草1 号高羊茅(登记号:299)为试验材料。

1.2 试验方法

选择饱满的高羊茅种子,置于50℃蒸馏水中浸泡过夜,用75%酒精浸泡30 s,无菌水冲洗3 次,然后用0.1% HgCl2浸泡4 min,无菌水冲洗5 ～6 次。将消毒后的种子置于培养皿中,放入光照培养箱(光周期为16 h 光照/8 h 黑暗,恒温22℃)中发芽7 d。发芽后转置于Hoagland 营养液中培养并进行不同胁迫处理。

1)低氮处理:将发芽后7 d 的健康高羊茅植株分别转移至无氮(营养液中NO3-被Cl-取代)、正常供氮(按照标准Hoagland 营养液配方配置)水培液中进行24 h 处理。

2)高盐处理:取发芽后7 d 的高羊茅植株放置于含有400 mmol·L-1NaCl 的Hoagland 营养液中处理24 h。

3)高温处理:将发芽后7 d 的高羊茅植株在42℃持续处理24 h。

4)干旱处理:采用模拟干旱的方法,将发芽后7 d的高羊茅植株置于30% PEG 6000(渗透势为-1.0 MPa)溶液中处理24 h。

分别于处理后0、0.5、1、2、6、12、24 h 对全部对照组和处理组高羊茅进行采样,剪取叶片,液氮速冻,-80℃保存待用。

1.3 RNA 提取及cDNA 合成

按照TRIzol RNA 试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)说明书提取高羊茅叶片中的总RNA;按照RNase Free DNase Ⅰ试剂盒(TaKaRa,日本)说明书对提取的总RNA 进行处理,去除残留基因组DNA。按照PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒(TaKaRa,日本)说明书将提取的总RNA 反转录成cDNA。

1.4 高羊茅NRT1 基因的克隆

依据GenBank 中检索到的拟南芥硝酸盐转运蛋白NRT1.1(At1g12110)基因序列,将其与高羊茅转录组数据进行BLAST 比对,获取高羊茅中的同源序列,并依据此序列,利用Primer 6.0 设计3′RACE、5′RACE的特异性引物及扩增NRT1.1 基因全长序列的引物(表1)。按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0(Invitrogen,美国)试剂盒说明书获得该基因的5′端序列,将PCR 产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化;按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech,美国)试剂盒说明书获得该基因的3′端序列,将PCR 产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。纯化后的PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司直接测序并进行全长拼接。

1.5 序列生物信息学分析

利用NCBI 进行开放阅读框的查询,通过BLAST 进行同源性分析,采用MEGA6 构建系统进化树[16]。采用Protparam(https:/ /web.expasy.org/protparam/)在线程序预测基因编码蛋白的理化性质;通过ProtScale(https:/ /web.expasy.org/protscale/)在线程序预测蛋白质疏水性/亲水性;采用在线软件SOPMA(https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)分析蛋白质二级结构。

1.6 表达模式分析

以高羊茅叶片mRNA 反转录成的cDNA 为模板,采用RT-qPCR 技术对低氮、干旱、热、盐胁迫不同处理时段高羊茅叶片NRT1.1 基因的表达进行定量分析。NRT1.1 基因用于RT-qPCR 的引物序列为NRT1-F:CGCAGGTGGAGCAAGTGAAG 和NRT1-R:AAGACGACGGAGTAGAGGATGG。内参基因为UBI,引物序列为UBI-F:CACCTCGATCACCCACCT CT 和UBI-R:AGGGTCTCCGATAACCTCCA。反应体系及程序按照Power 2 × SYBR Real-time PCR premixture(Baomanbio,美国)说明书进行。采 用2-ΔΔCT法[17]计算目标基因的相对表达量。试验设3次生物学重复。

1.7 数据统计与分析

采用Mircosoft Office Excel 2010 对数据进行统计,采用SPSS 22.0 对试验数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 高羊茅NRT1 基因cDNA 全长的克隆及分析

以高羊茅的总cDNA 为模板,使用3′RACE 引物3′810-1 和3′810-2 进行巢式PCR,获得1 条大小为1 208 bp 的片段(图1-A)。以5′RACE 引物A219-1(GSP1)、A219-2(GSP2)和A219-3(GSP3)进行巢式PCR,扩增出1 条大小为823 bp 的片段(图1-B)。对3′端和5′端进行拼接测序,获得了序列全长为2 328 bp 的高羊茅硝态氮转运蛋白基因NRT1,含1 848 bp 的开放阅读框,共编码氨基酸606 个(图1-C、图2)。预测其蛋白质分子量为193.9 kDa,理论等电点为4.81,不稳定系数为58.64,为不稳定蛋白;脂肪系数为19.12,平均亲水性为0.919。应用SOPMA 软件预测发现,该蛋白含有约32.63%α-螺旋,7.63%β-转角和53.73%不规则卷曲。

将高羊茅NRT1.1 与GenBank 中登录的其他物种的部分NRT1.1 家族成员基因序列进行比对,构建进化树。由图3 可知,NRT1.1 基因可以分成3 支:双子叶植物(A)、单子叶植物(B)、起源古老(C)。基因序列比对表明,高羊茅NRT1.1 与黑麦草NRT1.1 具有较高的同源性,与黑麦草(Lolium perenne)、小 麦(Triticumaestivum)、短柄草(Brachypodium distachyon)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max),芜菁(Brassica rapa)、拟南芥、番 茄(Solanum lycopersicum)、高 粱(Sorghum bicolor)、水稻、玉米(Zea mays)的同源性分别为49%、45%、42%、38%、37%、37%、35%、33%、30%、22%、14%。

图1 高羊茅NRT1.1 PCR 扩增电泳Fig.1 PCR product of NRT1.1 gene in F.arundinacea

2.2 高羊茅NRT1.1 基因表达模式分析

由图4 可知,氮胁迫处理组的NRT1.1 基因在胁迫0.5 h 时被显著诱导,胁迫1 h 时NRT1.1 相对表达量达到峰值(21.76),显著高于对照及其他处理,是对照组的35 倍,而在胁迫2 h 后氮处理组NRT1.1 基因的表达受到显著抑制,在胁迫6 ～24 h 呈无规律波动,且在胁迫24 h 时,氮处理组的NRT1.1 基因表达显著低于对照,仅约为对照的20%。在干旱胁迫条件下,胁迫1 h 内对照和干旱处理组之间NRT1.1 基因相对表达量差异不显著,在胁迫2、6 h 时干旱处理组NRT1.1 相对表达量显著高于对照,分别是对照的2.26 和1.63 倍,但在胁迫12 h 时二者的表达量均呈下降趋势,且差异不显著,而在胁迫24 h 时干旱处理组相对表达量再次升高,且显著高于对照,是对照的2.5 倍。在热胁迫条件下,处理开始时对照和热处理组NRT1.1 基因的表达均受到了抑制,但是随着胁迫时间的延长,二者的表达量均逐渐升高,在胁迫12 h时达到峰值后又开始下降,除了胁迫0 h 和1 h 时,其他处理时间热处理组表达量均显著高于对照。在盐胁迫条件下,对照的NRT1.1 基因表达始终受到抑制,虽有波动,但均显著低于0 h 时的表达量,处理组在胁迫0.5～24 h 时NRT1.1 相对表达量呈现低-高-低的趋势,在胁迫6 h 时达到峰值(1.22),是对照的3.98 倍,表明热胁迫处理组NRT1.1 基因表达在开始时受到抑制,然后被诱导表达,但随着时间的延长再次受到抑制。

图3 部分物种NRT1.1 基因序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the NRT1.1 gene from several plant species

图4 氮、干旱、热和盐处理后高羊茅根中NTR1 基因相对表达量Fig.4 The relative expressions of NRT1 gene in roots of F.arundinacea plant under nitrogen,drought,heat and salt treatment

3 讨论

NRT1.1(CHL1)是在植物中发现并鉴定的首个硝酸盐转运基因[22]。目前,对NRT1.1 的研究主要集中在模式植物拟南芥以及粮食作物水稻[14]和小麦[16]中,而有关NRT基因家族在高羊茅中的表达情况鲜见报道。本研究成功从高羊茅中克隆到1 个硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1。研究发现,NRT1 转运蛋白一般包含450～600 个氨基酸[23]。高羊茅蛋白NRT1.1 由606个氨基酸构成,与前人研究结果基本一致[23]。研究表明,NRT1 和NRT2 家族的基因亚型数目具有物种特异性,且基因表达还具有器官特异性[16]。本研究通过比对发现,高羊茅NRT1.1 基因的核苷酸和氨基酸序列与其他植物NRT1 的一致性较低,其中与黑麦草的一致性最高,为49%,其次为小麦(45%)和短柄草(42%)。系统进化树分析结果表明,高羊茅NRT1.1基因与黑麦草、玉米和小麦等禾本科植物有较高的同源性,与大豆、葡萄等作物的关系相对较远。

本试验中,实时荧光定量PCR 结果表明,高羊茅NRT1.1 基因的表达在低氮胁迫处理0.5 h 时开始显著升高,表明低浓度氮可以在短时间内诱导NRT1.1表达至峰值,高羊茅NRT1.1 应该是诱导型基因,其表达模式与茶树CsNRT1.1[24]和白菜BcNRT2[15]基因类似。Guo 等[25]对拟南芥的双亲和硝酸盐转运蛋白基因AtNRT1.1(CHL1)进行研究,发现与野生型植物相比,CHL1 突变体表达量显著高于野生型,且会导致CHL1 突变体的耐旱性增强。前人对小麦进行缺氮和干旱处理,发现缺氮和干旱胁迫会显著抑制小麦幼苗地上部分生长,导致生理活性降低,植物体内氮代谢紊乱,且干旱处理下小麦TaNRT1.1 和TaNRT1.2 基因的表达显著低于缺氮处理下的表达量[26-27]。本研究中高羊茅NRT1 基因的表达量也表现为干旱和热处理条件下低而氮处理条件下高,表明干旱或热处理会引起高羊茅植株生理活性降低,从而使NRT1 基因的表达量降低。

苏莉[27]对盐处理下的番茄进行研究,发现LeNRT1.1 和LeNRT1.2 的表达水平显著降低;LeNRT2.1 的表达水平也下降,但差异不显著,LeNRT2.3 的表达量在盐处理12 h 后略有增加。而Yao 等[28]对盐处理下野生耐盐西红柿(S.pennellii)和栽培番茄(S.lycopersicum)研究发现,其根组织中NRT1.1、NRT2.1 和NRT2.3 的表达量均呈下降趋势,而NRT1.2 呈现升高趋势这与本研究结果一致。此外,NRT1 不仅可作为硝酸盐转运蛋白,还可能是植物感受硝酸盐的信号受体[24]。高羊茅NRT1.1 基因的核苷酸和氨基酸序列与其他植物NRT1.1 的一致性较低。因此,对高羊茅硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1 的作用机制还需进一步研究和鉴定。

4 结论

本研究采用RACE 技术对高羊茅NRT1.1 基因cDNA 全长序列进行扩增,测得序列全长2 328 bp,编码606 个氨基酸,蛋白质分子量为193.9 kDa。进一步分析表明,与高羊茅NRT1.1 基因序列相似性最高的为黑麦草NRT1.1(49%)。实时荧光定量PCR 表达分析显示,低氮、干旱和热胁迫处理时,高羊茅叶片NRT1.1 表达量均显著提高,但其受低氮诱导速度快于干旱和热胁迫,盐胁迫则对NRT1.1 表达有一定的抑制。本研究为解析高羊茅NRT1.1 基因的表达模式奠定了分子生物学基础。