马铃薯StZnT11的电子克隆、表达及生物信息学分析

尉瑞敏，常燕楠，庞鹏湘，索艳云，郜刚

·生物技术与方法·

马铃薯的电子克隆、表达及生物信息学分析

尉瑞敏*，常燕楠*，庞鹏湘，索艳云，郜刚

山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041000

马铃薯锌转运蛋白(zinc transporter 11，) 对于维持细胞中锌稳态至关重要。通过研究在非生物胁迫和生物胁迫下的表达情况，为验证马铃薯在青枯菌生物胁迫过程中的作用奠定了基础。从前期工作获得的表达文库中得到EST序列，利用NCBI中的Blast工具，对原始序列进行同源性分析，选择与原始序列的相似度、覆盖度、e期望值最高的一条同源对象序列。通过电子克隆，得到基因。采用生物信息学方法对基因的基因序列及编码的氨基酸组成、理化性质、分子进化、磷酸化位点、高级结构等多角度进行分析。结果表明，该基因cDNA全长1 300 bp，编码348个氨基酸，编码蛋白含23个磷酸化位点，有1个信号肽，有9个跨膜区域，是定位在质膜上的疏水性蛋白。通过氨基酸序列比对，StZnT11蛋白与烟草、番茄和辣椒等植物中的锌转运蛋白同源性较高。实时荧光定量聚合酶链反应检测结果表明，在不同浓度的外源植物激素脱落酸 (ABA) 的作用下上调。组织定位检测提示主要表达于特定组织 (茎维管系统的韧皮部和叶片维管束)。这些结果为进一步进行该基因的实验克隆及功能验证研究提供了理论依据。

马铃薯，锌转运蛋白11，生物信息学，实时荧光定量PCR

锌是生物体中必需的微量元素，广泛参与各种生物过程。在酶催化、基因调控、大分子稳定性等方面发挥着尤为重要的作用。锌也是一种新兴的调节生理和病理事件的信号分子[1]。锌通过锌转运蛋白进入细胞。据估计，人类基因组编码的蛋白质中有10%是锌结合蛋白[2]。锌在行使细胞功能和调控高浓度的毒性方面都是必需的，因此严格控制锌稳态对细胞活力至关重要[3–4]。锌转运蛋白是跨膜蛋白，被称为阳离子转运促进剂，主要将锌转运到细胞外，或通过细胞内的储存细胞器积累多余的锌来控制细胞内锌的含量[5–6]。这些锌转运蛋白通过不透水的膜屏障运输Zn2+。据研究，锌转运蛋白有两个蛋白家族，SLC39 (也称为ZIP) 和SLC30 (也称为ZnT)。ZIP家族和ZnT家族分别负责锌的流入和流出[7–9]，在相反方向起作用以维持细胞锌稳态[10]。这些转运体存在于生物膜上[11–13]。

锌转运蛋白在植物发育中发挥重要作用。在拟南芥中，锌转运蛋白在根中表达以响应锌缺乏，比如ZIP1、ZIP3和ZIP4等锌转运蛋白。这些蛋白质负责植物中的锌摄取。过量表达锌转运蛋白还可以增加种子中锌的含量，从而增加谷物微量元素含量。拟南芥对ZIP蛋白家族的研究作出了重大贡献[8]。在水稻L.中，OsZIP4的过表达导致水稻植株锌分布紊乱[14]。OsZIP5的表达对水稻中锌分布起重要作用[15]。在烟草中，将克隆的粗糙脉孢菌锌转运蛋白基因 () 引入烟草中，其表达增强了植物锌的积累[16]，并且研究发现含有基因的转基因烟草植株具有较好的抗氧化能力。在小麦L.中，TdZIP1 (ZIP1转运体) 通过转运Zn2+可以改善小麦缺锌耐受性[17]。在苜蓿中，MtZIP2在根和茎中表达，并且通过Zn2+施肥上调[18]。综上所述，锌转运蛋白在植物细胞中对锌稳态的调节至关重要。研究发现，锌在细胞内信号通路中也起重要作用[19]。锌被认为是一种重要的信号分子，在正常细胞生理和病理生理学中发挥作用。正常情况下，锌被证明可以调节几种磷酸化依赖的信号级联反应，包括MAPKs和Akt，在细胞发育、增殖和死亡中发挥着重要作用。锌信号是由细胞内锌稳态控制的，而锌稳态又受到锌转运蛋白的调控，特别是ZIP和ZnT两个锌转运蛋白家族。因此，对于锌转运蛋白的研究是非常必要的。植物激素ABA在非生物胁迫反应中发挥重要的作用，特别是在干旱和盐碱胁迫中[20]，并且ABA被认为是植物免疫的重要参与者[21]。Audenaert等证明在番茄中ABA对灰霉病的免疫力有负面影响。这在拟南芥中也得到了支持，在拟南芥中ABA生物合成突变体2-12和3-2对灰霉病杆菌也表现出增强的抗性[22]。然而，关于马铃薯的表达、功能以及抗病方面的相关研究尚未见报道。

本研究利用马铃薯接种青枯菌，通过构建消减文库[23]，从中选取表达量较高的的EST序列。以NCBI数据库为基础，利用电子克隆得到马铃薯中编码基因的序列。采用生物信息学方法，对此基因所编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质、分子进化、磷酸化位点等多角度进行了分析并预测蛋白质的结构，进行定量表达分析与组织定位分析。为后续研究该基因的结构和功能奠定基础，并且为马铃薯在青枯病抗性分子机理研究方面提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物与菌株

本研究采用的马铃薯(二倍体基因型ED13)植株和青枯菌菌株PO41由中国农业科学院提供。马铃薯ED13基因型对青枯病具有抗性。将无菌块茎ED13种植到装有450 mL泥炭和蛭石(3︰1，体积比) 的花盆中(直径10 cm，高度15 cm)。在光照强度、光照时间和温度为2 000–3 000 lx、16h/8h (昼/夜)、23℃/18℃ (昼/夜) 的光照培养室中培养。

1.2 生物信息学分析

1.2.1 基因克隆

从前期工作[23]获得的表达文库中得到EST序列，利用NCBI中的BLAST工具，对EST进行同源性分析，选择与原始序列的相似度、覆盖度、e期望值最高的一条同源对象序列 (XM 015308168.1)。通过BioEdit软件拼接序列，得到新基因序列 ()。

1.2.2 基因序列分析

该基因的同源序列、编码蛋白的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、信号肽分析、磷酸化位点分析利用在线工具[24]Expasy、TMHMM Server V.2.0、PSORT、SignalP 4.1 Server、NetPhos软件完成；蛋白质二级及三级结构的预测利用PSIPRED和SWISS models等在线工具完成[25]。

1.2.3 基因的系统进化树构建

利用NCBI中BLAST程序对StZnT11蛋白进行检索，并选择与该蛋白同源性高的不同物种构建系统进化树。将包括番茄、烟草等不同物种植物在内的11条ZnT11蛋白序列放在同一个txt文档，然后再另存为fasta格式。最后利用MEGA 7.0软件建立StZnT11蛋白进化树。

1.2.4 基因的启动子分析

用PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/) 搜索启动子的 1 500 bp序列，定位潜在的顺式作用元件[25]。

1.3 激素处理

马铃薯植株长至7–8叶龄期，用100 µmol/L ABA处理，方法参考前人工作[26]。处理后0、12、24、48、60、72 h时间点[27]分别取样，液氮冷存，用于制备RNA。每次处理重复3次。

1.4 青枯菌处理

实验取9–10叶龄期的马铃薯幼苗，用108CFU/mL (600=0.2) 菌液处理，伤根灌菌法[28]接种。对照组用水处理。处理后0、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h时间点分别取样，液氮冷存，用于制备RNA。每次处理重复3次。

1.5 用RT-qPCR测定StZnT11基因表达

1.5.1 RNA制备

苗期马铃薯经激素处理和青枯菌诱导后取样用于总RNA制备，操作如下：取100 μg茎、叶组织，液氮速冻，研磨至粉状，加Trizol试剂4 ℃静置5 min，振荡混匀，室温静置5 min。加1/5体积氯仿，振荡混匀，室温静置5 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清，加等体积异丙醇，混和均匀，静置10 min。重复离心操作，弃上清取沉淀，用75%乙醇漂洗后置DEPC水保存备用。用LabChip GXll Touch微流控毛细管电泳系统测RNA的RIN值，用NanoDrop2000C超微量分光光度计测RNA的260/280和浓度。

1.5.2 cDNA全长的获得

取2 μg总RNA按照TransScript II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒操作，进行反转录成cDNA。反转录反应体系包括Total RNA、5×TransScriptII All-in-One SuperMix for qPCR、gDNA Remover、RNase-free 水，体积分别为1 μg、4 μL、1 μL、反应体系总体积20 μL。反应条件：50 ℃下进行15 min；在85 ℃下进行5 s。

1.5.3 Real-time PCR

以马铃薯基因为内参，引物为-F：5′-TATAACGAGCTTCGTGTTGCAC-3′和-R：5′-ACTGGCATACAGCGAAAGAACA-3′。靶基因特异正向引物和反向引物分别为-F：5′-GTTGCCATCGGAATCATAATCG-3′和-R：5′-ATGAGACTTGTCAATCGAGACC-3′。Real-time PCR反应体系包括正向引物(10 μmol/L) 0.4 μL，反向引物(10 μmol/L) 0.4 μL，2×TransStart Top GreenSuperMix qPCR 10 μL，模板(cDNA) 2 μL，加ddH2O至终体积为20 μL。RT-PCR使用以下程序执行：94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45个循环；实验重复3次。

1.6 荧光原位杂交

用PO41菌悬液处理9–10叶期的马铃薯幼苗。设置6、12、24、36、48、60、72、84、96 h时间点，分别在每个时间点取样，每株幼苗取少量叶片和2–3个茎段 (6–7 cm)。取样后置于10 mL离心管中，将所取植物材料浸泡在植物固定液(85 mL 50%乙醇、10 mL 37%甲醛和5 mL冰醋酸) 中固定。将经PCR扩增的基因片段制成RNA探针，标记5′-FAM，加入到之前制备的样品石蜡切片中。探针序列5′-CATCA GAGAC CTGTGACTGCCCTTGTGCGACT-3′、探针浓度为100 μmol/L，并用FITC (绿光) 标记。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析

本实验室前期[23]获得的EST序列在NCBI中运行Blast搜索到与之相似性较高的1条序列 (GenBank登录号XM 015308168.1)，利用BioEdit软件进行电子克隆，得到1 300 bp的序列 (图1)。

StZnT11蛋白的一级结构经预测，结果显示：分子式为C1712H2649N433O475S18，原子总数为5 287，分子量为37 474.56 Da，等电点为5.86，负电荷残基(Arg+Glu) 为26，正电荷残基(Arg+Lys) 为21，不稳定系数为32.61，脂肪系数为106.53，平均总亲水性为0.558。因此推测该蛋白是一个不稳定的疏水性的脂溶性蛋白。利用PSORT软件对StZnT11蛋白进行亚细胞定位分析。结果表明，该蛋白位于质膜上的分值最高，为9.27。故推断，StZnT11蛋白可能存在于植物的质膜上，并在质膜行使功能。通过PSIPRED软件对StZnT11蛋白进行二级结构预测，其中α-螺旋 (Alpha helix) 占49.28%，β-片层或伸展链 (Extended strand) 占11.75%，无规则卷曲 (Random coil) 占38.97%。通过TMHMM Server V.2.0软件对StZnT11蛋白进行跨膜预测，结果显示该蛋白含有9个跨膜区域，预测其为跨膜蛋白。通过NetPhos软件对StZnT11蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明该蛋白含23个磷酸化位点。利用SignalP 4.1 Server软件对StZnT11蛋白进行信号肽预测，发现该蛋白含有1个信号肽。故推测，该蛋白为分泌蛋白，在细胞质中合成后，将进行蛋白转运。

2.2 StZnT11蛋白的结构预测和分析

利用Robetta软件可以建立一个能够覆盖该蛋白序列全长的三维结构模型，如图2所示，可见StZnT11蛋白的主要空间结构由α-螺旋和无规则卷曲构成，与其二级结构预测分析一致。

图1 StZnT11基因的cDNA序列及编码的氨基酸

图2 StZnT11蛋白的三级结构预测

2.3 氨基酸同源性分析及进化树的构建

用MEGA7.0软件中的邻接法构建系统进化树，其中包含11个与StZnT11蛋白相关的不同物种的氨基酸序列。进行同源分析后，结果显示 (图3)，从系统发生树上的节点位置和分支长度上分析，StZnT11蛋白与烟草同属一支，与番茄、辣椒的同源性也很高。结果推断它们可能具有共同的起源。

2.4 StZnT11启动子预测和分析

从马铃薯基因组DNA中获得起始密码子ATG上游的1 500 bp碱基。如图4所示，启动子序列分析表明，在启动子的1500 bp区域有33种潜在的顺式作用元件。在许多位置发现了多个核心顺式作用元件，包括TATA box、CAAT box和参与脱落酸应答的顺式作用元件ABRE，以及参与防御和胁迫应答的顺式作用元件TC-rich repeats。启动子区有与激素相关的调控元件，说明参与激素调控，并且启动子区有与胁迫相关顺式作用元件，说明参与胁迫调控。

图3 StZnT11蛋白的系统进化树

图4 StZnT11启动子预测

2.5 植物激素诱导的StZnT11表达模式

的表达受外源激素ABA的上调 (图5)，该基因的相对表达在ABA处理72 h后达到峰值。但在96 h时表达量显著降低，而第120 h时表达量又开始上升。表明激素ABA的处理诱导了的表达，说明的表达可能在激素信号转导过程中发挥重要作用。

2.6 青枯菌诱导的StZnT11表达模式

使用Real-time PCR方法对接种青枯菌的马铃薯幼苗在不同时间点的诱导表达进行比较分析，以确保在青枯菌侵染下mRNA的表达是否发生。比较分析表明：基因的表达受青枯菌上调 (图6)，该基因在青枯菌处理6、12、24 h中相对表达量较低；在36 h和48 h中几乎不表达；但在之后的60 h和72 h内表达量又开始上调；直到84 h相对表达量达到最高；而在之后的96 h和108 h中表达量显著下降。由于对照组一直处于较低的表达状态，因此与对照组相比较，当受到病原菌胁迫时，基因的表达量会上调。推测基因在马铃薯抗青枯病方面发挥重要作用。

2.7 StZnT11表达的组织定位

荧光原位杂交分析显示 (图7)，mRNA主要分布在茎维管系统的韧皮部 (图7-A3) 和叶片维管束 (图7-C3)。此外，在对照植株中观察到弱杂交信号 (图7-B3和7-D3)。这些结果表明，基因定位在维管束，表现出一定的组织特异性，这可能与青枯菌所引起的维管束系统病害青枯病有关。

图5 实时定量PCR分析激素ABA处理马铃薯苗StZnT11基因相对表达量

图6 利用实时定量PCR分析接种青枯菌的马铃薯幼苗StZnT11基因相对表达量

图7 StZnT11定位在茎维管系统的韧皮部和叶片维管束

3 讨论

锌转运蛋白在植物中运输细胞之间以及细胞内的亚细胞之间的金属[8]。调节细胞的多种生命活动。锌转运蛋白的有效利用可以使人们更好地了解植物体内锌稳态和抗性的机制[33]。研究表明拟南芥的AtMTP1定位于液泡膜，参与将细胞质中过量的Zn固定到液泡中以维持Zn的动态平衡[34]。在水稻中，OsZIP5对水稻中锌分布起重要作用[15]。在烟草中，锌转运蛋白Tzn1的表达增强了植物中锌的积累[16]。这些结果与亚细胞定位分析结果一致，锌转运蛋白定位于质膜，并在质膜通过转运Zn2+发挥作用。从前期工作[23]获得的表达文库中得到EST序列，利用电子克隆得到马铃薯中编码StZnT11蛋白的cDNA 序列。采用生物信息学方法，对此蛋白质从氨基酸组成、理化性质、分子进化、磷酸化位点、高级结构等多角度进行了分析。结果表明该基因cDNA全长1 300 bp，编码348个氨基酸，编码蛋白含23个磷酸化位点，有1个信号肽，有9个跨膜区域，是定位在质膜上的疏水性蛋白。通过氨基酸序列比对，StZnT11蛋白与烟草、番茄和辣椒的锌转运蛋白同源性高，结果推断它们可能具有共同的起源。

植物激素是植物生长发育的核心调节因子，调节植物对生物和非生物环境胁迫的响应。启动子分析结果表明在许多位置出现多个核心顺式作用元件，包括TATA、CAAT box和参与脱落酸应答的顺式作用元件ABRE，以及参与防御和胁迫应答的顺式作用元件TC-rich repeats。结合植物激素ABA诱导的表达结果表明，的表达可能在激素信号转导过程中发挥重要作用。马铃薯青枯病属于维管束系统病害，青枯菌从植物根部入侵，到木质部导管发挥作用，通过维管束迅速扩张到地上部分，导致导管丧失功能，进一步引起植物萎蔫，甚至死亡。青枯菌诱导的表达与对照组相比较，当植物受到青枯菌胁迫时，基因的表达量会上调。结合荧光原位杂交结果显示，以组织特异性的方式在维管束表达，而青枯菌作用位置也在维管束。因此推测基因在马铃薯抗青枯病方面发挥重要作用。

后续可以使用实验手段克隆基因，利用基因过表达、基因沉默和亚细胞定位对的功能进行验证。目前在拟南芥[8]、水稻[14]、小麦[17]等植物中对进行了相关的研究，还尚未有在马铃薯中研究该蛋白功能的相关报道。笔者借鉴前人的经验对马铃薯中的锌转运蛋白进行研究，推测可能为抗病基因，为选育对青枯病具有高抗性的新品种马铃薯奠定基础。

[1] Yamasaki S, Sakata-Sogawa K, Hasegawa A, et al. Zinc is a novel intracellular second messenger. J Cell Biol, 2007, 177(4): 637–645.

[2] Andreini C, Banci L, Bertini I, et al. Counting the zinc-proteins encoded in the human genome. J Proteome Res, 2006, 5(1): 196–201.

[3] Taylor KM, Vichova P, Jordan N, et al. ZIP7-Mediated intracellular Zinc transport contributes to aberrant growth factor signaling in antihormone-resistant breast cancer cells. Endocrinology, 2008, 149(10): 4912–4920.

[4] MacDiarmid CW, Gaither LA, Eide D. Zinc transporters that regulate vacuolar Zinc storage in. EMBO J, 2000, 19(12): 2845–2855.

[5] Palmiter RD, Findley SD. Cloning and functional characterization of a mammalian Zinc transporter that confers resistance to Zinc. EMBO J, 1995, 14(4): 639–649.

[6] Nies DH, Silver S. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. J Ind Microbiol, 1995, 14(2): 186–199.

[7] Zhao H, Eide D. The yeast ZRT1 gene encodes the Zinc transporter protein of a high-affinity uptake system induced by Zinc limitation. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(6): 2454–2458.

[8] Grotz N, Fox T, Connolly E, et al. Identification of a family of Zinc transporter genes fromthat respond to Zinc deficiency. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(12): 7220–7224.

[9] Lichten LA, Cousins RJ. Mammalian Zinc transporters: nutritional and physiologic regulation. Annu Rev Nutr, 2009, 29: 153–176.

[10] Huang LP, Tepaamorndech S. The SLC30 family of Zinc transporters-A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Mol Aspects Med, 2013, 34(2/3): 548–560.

[11] Franklin RB, Feng P, Milon B, et al. hZIP1 Zinc uptake transporter down regulation and Zinc depletion in prostate cancer. Mol Cancer, 2005, 4: 32.

[12] Kambe T, Hashimoto A, Fujimoto S. Current understanding of ZIP and ZnT Zinc transporters in human health and diseases. Cell Mol Life Sci, 2014, 71(17): 3281–3295.

[13] Kambe T, Tsuji T, Hashimoto A, et al. The physiological, biochemical, and molecular roles of Zinc transporters in Zinc homeostasis and metabolism. Physiol Rev, 2015, 95(3): 749–784.

[14] Ishimaru Y, Masuda H, Suzuki M, et al. Overexpression of the OsZIP4 Zinc transporter confers disarrangement of Zinc distribution in rice plants. J Exp Bot, 2007, 58(11): 2909–2915.

[15] Lee S, Jeong HJ, Kim SA, et al. OsZIP5 is a plasma membrane Zinc transporter in rice. Plant Mol Biol, 2010, 73(4/5): 507–517.

[16] Dixit P, Singh S, Vancheeswaran R, et al. Expression of a Neurospora crassa Zinc transporter gene in transgenic Nicotiana tabacum enhances plant Zinc accumulation without co-transport of cadmium. Plant Cell Environ, 2010, 33(10): 1697–1707.

[17] Durmaz E, Coruh C, Dinler G, et al. Expression and cellular localization of ZIP1 transporter under Zinc deficiency in wild emmer wheat. Plant Mol Biol Rep, 2011, 29(3): 582–596.

[18] Burleigh SH, Kristensen BK, Bechmann IE. A plasma membrane Zinc transporter fromis up-regulated in roots by Zn fertilization, yet down-regulated by arbuscular mycorrhizal colonization. Plant Mol Biol, 2003, 52(5): 1077–1088.

[19] Kolenko V, Teper E, Kutikov A, et al. Zinc and Zinc transporters in prostate carcinogenesis. Nat Rev Urol, 2013, 10(4): 219–226.

[20] Tuteja N. Abscisic acid and abiotic stress signaling. Plant Signal Behav, 2007, 2(3): 135–138.

[21] Grant MR, Jones JDG. Hormone (Dis) harmony moulds plant health and disease. Science, 2009, 324(5928): 750–752.

[22] Adie BAT, Pérez-Pérez J, Pérez-Pérez MM, et al. ABA is an essential signal for plant resistance to pathogens affecting JA biosynthesis and the activation of defenses in. Plant Cell Online, 2007, 19(5): 1665–1681.

[23] Gao G. Cloning and expression of defence-related genes induced byin potato[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2008 (in Chinese).郜刚. 青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因克隆与表达[D]. 北京: 中国农业科学院, 2008.

[24] Mirzaei K, Bahramnejad B, Shamsifard MH, et al.identification, phylogenetic and bioinformatic analysis of argonaute genes in plants. Int J Genomics, 2014, 2014:1–17.

[25] Pang PX, Shi L, Wang XJ, et al. Cloning and expression analysis of the StCUL1 gene in potato. J Plant Biochem Biot Online, 2019.

[26] Blaudez D, Kohler A, Martin F, et al. Poplar metal tolerance protein 1 confers Zinc tolerance and is an oligomeric vacuolar Zinc transporter with an essential leucine zipper motif. Plant Cell Online, 2003, 15(12): 2911–2928.

[27] Denancé N, Ranocha P, Oria N, et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant J, 2013, 73(2): 225–239.

[28] He LY, Sequeira L, Kelman A. Characteristics of strains offrom China. Plant Dis, 1983, 67: 1357–1361.

[29] Zelman AK, Dawe A, Gehring C, et al. Evolutionary and structural perspectives of plant cyclic nucleotide- gated cation channels. Front Plant Sci, 2012, 3: 95.

[30] KimM, Lee S. Bootstrap entropy test for general location-scale time series models with heteroscedasticity. J Stat Comput Simul, 2018, 88(13): 2573–2588.

[31] Patil SA, Burnham KP, Kovner JL. Nonparametric estimation of plant density by the distance method. Biometrics, 1979, 35(3): 597–604.

[32] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol, 2016, 33(7): 1870–1874.

[33] van der Zaal BJ, Neuteboom LW, Pinas JE, et al. Overexpression of a novelgene related to putative Zinc-transporter genes from animals can lead to enhanced Zinc resistance and accumulation. Plant Physiol, 1999, 119(3): 1047–1055.

[34] Kobae Y, Uemura T, Sato MH, et al. Zinc transporter ofAtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in Zinc homeostasis. Plant Cell Physiol, 2004, 45(12): 1749–1758.

cloning, expression and bioinformatics analysis ofin

Ruimin Yu*, Yannan Chang*, Pengxiang Pang, Yanyun Suo, and GangGao

College of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen041000, Shanxi, China

Zinc transporter 11 () is very important for maintaining zinc homeostasis in cells. The study on the expression ofunder abiotic stress and biotic stress laid a foundation for verifying the role of potatoin the process of biotic stress ofspecies complex. According to the designated EST sequence, the homology of the original sequence was analyzed by using the Blast tool in NCBI, and a homologous object sequence with the highest similarity, coverage and e expectation value was selected.gene is obtained by Silico Cloning. The sequence and coding amino acid composition, physicochemical properties, molecular evolution, phosphorylation site and advanced structure ofgene were analyzed by bioinformatics method. The results showed that the cDNA gene is 1 300 bp in length, encoding a protein containing 348 amino acid residues, including 23 phosphorylation sites, one signal peptide and nine transmembrane regions, and is a hydrophobic protein located on the plasma membrane. Through amino acid sequence alignment, StZnT11protein has a high homology with zinc transporter from tobacco, tomato, pepper and other plants. The results of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction showed that,is up-regulated by different concentrations of exogenous plant hormone abscisic acid (ABA). Tissue localization showed thatwas mainly expressed in specific tissues (phloem and leaf vascular bundles of stem vascular system). These results provide a theoretical basis for further experimental cloning and functional verification of the gene.

potato, zinc transporter 11, bioinformatics, real-time fluorescent quantitative PCR

尉瑞敏, 常燕楠, 庞鹏湘, 等.马铃薯的电子克隆、表达及生物信息学分析. 生物工程学报, 2020, 36(2): 362–371.

Yu RM,Chang YN,Pang PX, et al.cloning, expression and bioinformatics analysis ofin. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 362–371.

May15, 2019;

July25, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No.31771858).

Gang Gao. Tel: +86-357-2051197; E-mail:gaogang@sxnu.edu.cn

10.13345/j.cjb.190200

*This authors contributed equally to this study.

国家自然科学基金 (No.31771858) 资助。

2019-08-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190805.1059.005.html

(本文责编 郝丽芳)