藤仓赤霉菌赤霉素生物合成及代谢调控研究进展

王冰璇，司文，吴烨飞，张心齐，汪石莹，吴酬飞，林海萍，尹良鸿

·综 述·

藤仓赤霉菌赤霉素生物合成及代谢调控研究进展

王冰璇1，司文3，吴烨飞3，张心齐1，汪石莹1，吴酬飞2，林海萍1，尹良鸿1

1 浙江农林大学 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，浙江 临安 311300 2 湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 313000 3 浙江钱江生物化学股份有限公司，浙江 海宁 314400

赤霉素是最重要的植物生长调节剂之一，在农业生产中得到越来越广泛的应用，具有广阔的市场前景，但其工业化的高生产成本严重制约着它的广泛应用。近年来，利用生物技术提升赤霉素产量日益成为研究热点。赤霉素生物合成是多种酶协同作用的过程，阐明赤霉素的生物合成机制，利用代谢工程策略调控代谢流量，对提高赤霉素产量至关重要。文中综述了当前藤仓赤霉菌赤霉素生物合成途径、关键酶、环境因素、代谢流调控等方面的研究进展，在代谢调控方面进行了展望，以期为实现赤霉素稳产高产提供思路。

藤仓赤霉菌，赤霉素，生物合成，代谢调控，关键酶

赤霉素 (Gibberellins，GA) 是一种天然的植物生长调节剂，与生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯被称为植物五大激素[1]。1934年，GA由日本学者从恶苗病菌的发酵滤液中得到，并于1938年正式命名为GA。至今已发现不同结构的GA有136种，总称赤霉素类 (GAs)[2]。具有生物活性的GA主要有GA1、GA3、GA4、GA7等，它们的化学结构如图1所示[3–4]。

研究表明，GA对植物生长具有多种调控功能，可促进茎的伸长、诱导植株开花、打破种子休眠、增强植物抗性等[6–7]，因而在农业、林业、食品酿造等方面有着巨大的应用潜力。植物、细菌和真菌的代谢物中均有GA产生[8–10]，但在微生物体内的生理作用尚未研究透彻。

目前GA可通过化学合成、植物提取和微生物发酵三种方式获得。因为前两种方式成本高、效率低，而微生物发酵法周期短、效率高，所以微生物发酵法被广泛应用于工业大规模生产[5]。目前，藤仓赤霉菌(W.为有性态，无性态为藤仓镰孢菌)是工业生产的主要菌种，国内GA3工业生产水平在1 200–2 000 mg/L，国外深层液态发酵可达到3 900 mg/L[11]，GA4国内产量大约在600–800 mg/L[12]，但随着GA的应用越来越广泛，其产量已远远不能满足市场需求，因此探索提高GA产量的方法十分必要。GA的生物合成途径是一个多种酶参与的复杂过程，因此对途径中关键酶及酶基因的研究是实现GA定向调控必不可少的，再加上基因技术的不断发展，利用基因工程菌生产GA已成为研究热点。本文就中GA的合成途径和相关酶及代谢调控研究进展进行综述，以期为提高GA的产量提供思路。

图1 GA1、GA3、GA4、GA7的化学立体结构[5]

1 GAs生物合成途径

中GA的生物合成途径[13–14]已研究得较为清楚 (图2)，主要包括3个阶段：牻牛儿牻牛儿焦磷酸 (Geranylgeranyl diphosphate，GGPP) 的合成、由GGPP合成GA12醛、GA12醛转化为其他种类的GA。

1.1 GGPP的生物合成

该阶段是中GA合成的第一阶段，其中GGPP是二萜类化合物的共同合成前体，首先以内源乙酰-CoA[4]为底物，在3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzymeA，HMG-CoA) 还原酶 (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR) 的催化下生成GA的前体物质甲羟戊酸 (Mevalonic acid，MVA)，再生成异戊烯焦磷酸 (Isopentenyl pyrophosphate，IPP)、二甲基丙烯焦磷酸 (Dimethyl allyl pyrophosphate，DMAPP)、牻牛儿基焦磷酸 (Geranyl pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸 (Farnesyl pyrophosphate，FPP)，IPP与FPP相接，形成GGPP，这是二萜的共同前体[8]。

图2 藤仓赤霉菌赤霉素的合成途径[5,15]

1.2 GA12醛的生物合成

第二阶段GA12醛的合成过程中，GGPP经过古巴焦磷酸合成酶 (Copalyl pyrophosphate synthase，CPS)、内根-贝壳杉烯合成酶 (- kaurenesynthase，KS) 的催化，生成内根-贝壳杉烯。高度疏水的内根-贝壳杉烯在细胞色素P450-4、P450-1单氧酶的一系列催化下生成内根-贝壳杉烯酸、GA12醛[15]。

1.3 GAs的生物合成

在该阶段GA可通过P450氧化酶同工酶的氧化，生成一系列不同种类的GA。首先GA12醛在P450-1酶的作用下，经羟基化生成GA14醛，之后转化为GA14[16]。GA14由P450-2酶催化转化为GA4[17]，GA4既可以在1,2-去饱和酶的作用下转化成GA7，又可在P450-3酶的作用下转化为GA1。最后，GA7在P450-3酶的作用下生成GA3。

2 调控GAs合成的关键酶

2.1 3-羟基-3-甲基-戊二酰CoA还原酶 (HMGR)

HMGR是GA生物合成途径中第一个限速酶，也是GA等萜类代谢过程中的关键调控位点，催化HMG-CoA形成MVA[18]。Giordano等[19]研究GA、胡萝卜素合成途径时发现，洛伐他汀 (Lovastatin) 作为该酶的抑制剂，只对GA的积累有作用，却不影响胡萝卜素的积累和菌丝生长，说明有两种不同的合成路径在该菌株体内。通过分子杂交、PCR扩增等表明合成基因是同一的，但存在对Lovastatin的亚细胞结构障碍。有研究发现HMGR是由、、这3个基因组成的基因家族所编码，且基因家族不同成员的表达量影响MVA途径中“碳流”的变化，从而造成萜类产物的种类和产量不同[20]。Albermann等[21]发现，编码的HMGR由两部分组成，分别为具有8个跨膜区域的疏水性N端结构域和亲水性C端结构域，对的C端序列进行超表达，结果显示GA3效价比亲本菌株增加260%。MVA途径存在于所有萜类化合物的合成过程中，穗槐二稀同GA一样，同属于萜类化合物，Keasling等[22]通过实验证明，HMGR是穗槐二稀生成过程中的限速酶，而且在酵母中过表达tHMGR后，穗槐二烯产量大幅度提高，说明通过增加MVA代谢流可以作为提高GA产量的一个新思路。

2.2 牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合酶 (GGPPS)

GGPPS同HMGR、FPP合成酶 (FPPS) 共同参与调控GGPP的生成。Tudzynski等[23]敲除编码GGPPS基因后，发现该菌株不再合成GA。Albermann等[21]将超表达，GA总产量增加近135%，说明编码的GGPPS参与了GA合成的关键步骤。对中GA合成途径中HMGR、FPPS、GGPPS等基因超表达，发现和超表达后的菌株GA积累水平急剧降低，可能是过多的前体物质引起了该途径的反馈抑制。

2.3 多功能合酶 (CPS/KS)

CPS/KS作为中的一种多功能合酶，同真菌中其他二萜环化酶一样，主要以双功能环化酶的形式存在[24]。在真菌中，由编码的CPS/KS双功能酶，能够直接催化两步环化反应，使GGPP向内根-贝壳杉烯转化。而与紧密连锁，共用一个839 bp的启动子，这可能更好地促进GGPP合成[25]，而且有研究表明，将两者同时超表达，总GA水平可提升111 mg/(L·g)[21]。

2.4 细胞色素P450酶系

细胞色素P450酶在植物、动物、细菌和真菌中广泛存在，是自然界中含量最丰富、底物谱最广的催化酶系。Tudzynski等[23]通过PCR技术、差异基因筛选、限制酶介导的基因重组等方法发现在中，P450酶与控制GA合成的另外两个基因、位于同一条染色体上，组成了一个基因簇，但转录方向并不一样，该基因簇中，除外，其余均受氮源抑制，如图3所示。Tudzynski等[26]敲除了、，发现该敲除株只产生GA4和GA7。敲除，则不再产生GA3和GA7，而GA1和GA4则大幅增加。只敲除，GA4和GA7的产量提高，但产物中不再有GA1和GA3。将和同时敲除，则该菌株只生成GA4，并且其产量比野生型高7–8倍。说明编码GA4去饱和酶，催化GA4向GA3转化，编码细胞色素P450-3单氧酶，催化GA7到GA3和GA4到GA1的反应。位于右侧，编码P450-4单氧酶，该酶催化内根-贝壳杉烯生成内根-贝壳杉烯[27]。和是共享双向启动子的转录单元，P450-1单氧酶主要催化内根-贝壳杉烯酸到GA14：7β-羟基化、氧化C-6位收缩B环、3β-羟基化、氧化C-7位，分别转化为内根-7α-贝壳杉烯酸、GA12醛、GA14醛、GA14[8]，其中3β-羟基化是代谢调控或诱变筛选获得高产GA4+7的最主要途径[28]。位于的右侧，编码P450-2单氧酶，可催化GA14C-20位氧化，从而转化为GA4。是唯一不受高浓度氮源抑制的基因，位于最下游，编码细胞色素P450-3单氧酶，催化GA7到GA3和GA4到GA1的反应[27]。

2.5 谷氨酰胺合成酶 (GS)

谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase，GS) 是藤仓赤霉菌中合成谷氨酰胺的唯一酶，还是参与氨代谢的关键酶。研究表明，高浓度的谷氨酰胺能抑制所有氮源限制基因的表达，当GS被移除后，胞内谷氨酰胺处于较低水平，GA合成基因则会大量表达，导致GA大量合成[29]。然而有研究表明，当敲除GS的编码基因后，GA水平明显下降，说明涉及赤霉菌的代谢调控[30]。

2.6 腺苷酸环化酶 (AC)

腺苷酸环化酶 (Adenylel cyclase，AC) 是参与调节细胞内多种生理功能的膜整合蛋白，是调控真菌中环腺苷磷酸 (cAMP) 水平的关键酶[31]。大量研究表明，许多丝状真菌的发育、生长、抗逆等都受细胞跨膜信号cAMP转导途径的调控[32]。Michielse等[33]与García-martínez等[34]证明，在中，当敲除编码腺苷酸环化酶基因后，GA产量减少。Studt等[35]发现，AC被异三聚体G蛋白 (Heterotrimeric G protein) α亚基刺激，合成cAMP后，蛋白激酶A (Pka) 被激活，进而Pka通过对目的蛋白进行磷酸化修饰来改变蛋白活性，调控代谢过程。

图3 藤仓赤霉菌中赤霉素生物合成基因簇[15]

3 调控GAs合成的环境因素

微生物培养基组分以及培养条件的变化均会引起GA合成代谢过程中关键酶及基因的变化，从而直接或间接调控着GA的合成代谢。

3.1 营养元素的调控

3.1.1 碳源

碳源作为微生物生长的物质基础，一方面为细胞生长提供必需的物质能量，另一方面也为代谢产物提供原料。葡萄糖、淀粉、蔗糖是目前最常使用的碳源，过高的碳源浓度会因代谢抑制而限制GA的合成[36]。González等[37]向培养基中添加淀粉和蔗糖的混合物能大幅提升GA产量。 刘文芳等[38]认为液化淀粉是GA发酵的最优碳源。甜菜渣、糖蜜、秸秆等也可为GA生产提供碳源。刘风莉等[39]在研究串珠镰孢菌固态发酵产GA3时发现，在培养基中添加酶解后的秸秆，产量能得到有效提高，达到789.14 mg/kg。经研究发现，开始时高浓度的碳源会对GA3的合成产生抑制，但氮源耗尽时少量的碳源补充有利于细胞生长和GA3积累[40]。可见碳源的种类及比例对赤霉素的产量有明显的影响，因此可通过合适的碳源配比来提升赤霉素生产水平。

植物油可作为迟效碳源，不仅为微生物生长发育提供能量，还能缓解中间代谢物的阻遏效应。植物油经过培养环境中脂肪酶的分解作用，形成脂肪酸和甘油，其中脂肪酸通过代谢途径中的β-氧化，形成乙酰辅酶A参与合成。例如庄木坤等[28]认为在培养过程中添加芝麻油、橄榄油、豆油能够提升GA3的效价。在抗生素的生产中，植物油也能提高产物效价，如Park等[41]在头霉素C的研究过程中发现，8% (/) 的菜籽油与单一碳源淀粉相比，目的产物产量提高2倍。陈贵斌等[42]发现以豆油为部分碳源进行头霉素C发酵，有利于提高产素能力。将多种植物油加到红霉素发酵培养基中，可有效提升红霉素积累水平[43]。

3.1.2 氮源

在的GAs合成途径中，高浓度的氮水平对GAs合成的影响尤为显著。Tudzynski等[13]克隆了基因，该基因参与中氮代谢，而且缺失基因的菌株只能利用谷氨酸盐和铵盐作为氮源，其GA产量较低。Mihlan等[29]证实编码的蛋白质可以与这6个基因的启动子结合。因此，的缺失将会造成这6个受氮调控基因的表达水平下降。敲除谷氨酰胺合成酶基因会造成GAs和比卡菌素产量急剧下降，说明有可能也参与GAs的生物合成氮代谢[30]。Wong等[44]发现，在氮源充足时，areA的活性受与的影响。氮源不足的情况下，敲除会造成GA生物合成途径中受氮调控基因的表达量急剧提升。敲除和则导致GA合成基因不表达，合成比卡菌素合基因提高。因此，与相互作用，共同参与赤霉菌的氮代谢调控，且二者不可相互替代[45]。

氮源种类也影响GAs的生物合成。常用的无机氮源有氯化铵、硝酸钾、硫酸铵，有机氮源有玉米浆粉、蛋白胨[28]、豆粕粉、花生粉等[46]。王卫等[47]在培养基中加入不同种类的花生饼粉，结果表明，冷轧花生粉因含有大量蛋白大分子，而能够有效提升GA3产量。李明森等[48]在研究GA3固体发酵时发现，向含有麸皮玉米面的培养基中分别添加硫酸铵、豆粕粉、花生饼粉、硝酸钾都使GA3效价降低，这可能是因为额外添加氮源造成营养物质消耗、菌体生长过快，限制了培养基的传热与溶氧，从而造成GA3效价降低。Lale等[49]研究表明，以小麦蛋白作为氮源，其GA3效价要比脱脂豆粕作为氮源产量要低，但GA4效价却大幅提高。这说明氮源还可能对酶活性产生作用，从而导致GA种类和产量发生变化。

3.1.3 无机盐、氨基酸及其他物质

无机盐不仅为赤霉素积累的提供营养物质，为酶活性提供离子，还能控制氧化还原电位，平衡细胞渗透压。如储修云等[50]通过在培养基中添加镁、硼、磷等提高了GAs的效价产量。氨基酸的种类及浓度影响GA的生产，缬氨酸能降低其产量，少量的酪氨酸、谷氨酸能提高GA生产水平。维生素C也会阻碍GA3的合成[51]。在萜类的研究过程中发现，添加促进剂或诱导剂也能促进产物合成，如三孢布拉霉菌产番茄红素的发酵中，添加β-紫罗酮、青霉素等物质后，番茄红素产量能高达1.54 g/L[52]。赤霉素也是萜类的一种，但目前赤霉素关于此方面研究较少，有待于深入探究。

3.2 培养条件

3.2.1 pH

培养基中不同的pH值会影响一些营养物质的电离程度，当菌体摄取这些营养物质时，会造成细胞内一些大分子如核酸、蛋白质等酸碱度变化，进而使它们的生物活性发生改变。微生物的生长和次级代谢产物与pH值有非常重要的关系。对于GA3的生产，pH值大于6.0，菌株主要产GA4和GA7，小于3.5主要产GA1[14]。一方面可能是因为过高的pH导致GA4和GA7等中间代谢物分泌到胞外而不能再转运回胞内继续合成终产物GA3，另一方面可能是pH对GAs合成途径中的酶产生了影响[10]。Bilkay等[53]指出pH为5时，黑曲霉发酵GA3产量达到0.25 g/L；当pH为3和7时，GAs的产量分别为0.1 g/L和0.15 g/L。李明森等[52]发现pH为7时固体培养GA3效价最高，为9.832 g/kg。张文宣等[54]在研究GA4+7大罐生产过程中，用流加补氨水替代碳酸钙进行pH调节，结果显示，调节pH值能明显提高GA4+7效价。由此可见，pH会制约GAs的种类及含量，因此在实践生产中，可通过调节发酵过程中的pH来指导生产。

3.2.2 温度

温度与微生物的生长存活密不可分，不同的温度可促进不同的酶活性，进而提升目的代谢物的积累速度。有研究指出，用串珠镰孢、作为生产菌株生产GA适宜温度有25 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃[55–58]。Jefferys[59]指出，29 ℃利于产GA3，高于29 ℃效价降低，31–32 ℃时利于菌体生长。Meleigy等[60]认为，30 ℃利于串珠镰孢产GA3，高于30 ℃效价降低，40 ℃抑制GA3积累。Escamilla等[11]研究证明，30 ℃有利于流化床培养固定化产GA。王卫等[46]发现对GA3发酵过程实施分阶段变温控制策略比恒温发酵产量提高了11.14%。因此，在GAs生产过程中，可通过菌株的种类来探究适宜的温度，从而提高GAs产量。

3.2.3 溶氧

溶氧在微生物代谢中也发挥着巨大的作用，影响着细胞还原力NADPH和能量代谢。生长和GA合成过程都要消耗氧气，因为此途径中有大量氧化反应，如脱氢酶、双加氧酶、P450单氧酶所参与的反应都需要消耗氧气，所以足够的溶氧量必不可少[13]。在GAs实际生产中，溶氧控制一般通过增大通气量、补水、降温、提高转速、添加表面活性剂、氧载体等方式解决。Borrow等[61]发现，在培养体系中通入少量二氧化碳能显著提升GA3产量，达到0.62 g/L，而不添加二氧化碳GA3的产量仅0.42 g/L。Machado等[62]在研究固体发酵时发现，在72 h之前提供低溶氧 (0.24 L/(h·kg))环境，之后提供高供氧 (0.72 L/(h·kg)) 环境，GA3产量可达到最高。但是发酵过程中溶氧过高也会因菌体生长过快、副产物的大量生成等原因导致GAs产量降低。

过低溶氧量一方面会造成菌丝体内的代谢过程发生变化，如厌氧呼吸会产生大量的乙酸、乙醇等，对细胞产生毒害；另一方面导致pH下降、菌丝体自溶、发酵终止、效价偏低。因此，在GAs的发酵过程中，充足的溶氧量至关重要。

4 调控GAs合成的代谢流

4.1 阻断分支途径关键酶基因调控

在的GAs合成过程中，可通过敲除分支途径关键酶基因，从而提高GAs产量，如Wiemann等[63]将藤仓赤霉中编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶 (Phosphopantetheinyl transferase) 的基因敲除，造成聚酮化合物合酶 (PKSs) 和非核糖体缩氨酸合酶 (NRPSs) 活性丧失，从而导致与PKSs和NRPSs相关的下游代谢反应受到阻断，代谢流向GAs合成途径转移，使GA效价得到提升。目前，赤霉素在该方向的研究较少，可借鉴相关萜类化合物的研究作为参考。如番茄红素作为萜类化合物的一种，且在基因调控方面研究较为透彻，如Miura等[64]将番茄红素合成基因转入原本不产番茄红素的产蛋白假丝酵母后，该菌株开始产生番茄红素，通过切断其竞争途径麦角固醇的代谢通路，并使HMGR过表达，最终番茄红素产量提高7倍[65]。

4.2 前体物质调控GAs合成

前体物是指加入到培养基中，能被微生物直接利用或参与目标产物的生成，通常有脂肪酸、柠檬酸、糖类、C1化合物等一些初级代谢产物。

微生物在经过长期的进化演变，其代谢通常不产生多余的物质，调控点通常控制初级代谢分支首个酶的活性或合成，而添加前体物可以令次级代谢过程避开初级代谢对目标产物的调控。

但前体物的添加浓度不可过高，对菌有毒害作用，从而影响目标代谢物产量，过低则作用不显著。因此，前体物调控策略的研究对实现GAs高产稳产十分必要。Cihangir[66]以MVA作为前体物加到浸没培养的黑曲霉中，探究MVA对该菌的生长和GA3产量的影响，发现添加少量MVA使GA3的产量提高近50 mg/L。王卫等[67]发现在培养基中添加草酰乙酸、维生素B2、葡萄糖酸钙能够大大提高GA3产量。目前，前体物质影响GA合成的相关研究较少，可通过其他萜类物质的相关研究，为提高GAs产量提供思路，如萜类化合物紫杉醇的培养过程中，添加前体物苯甲酸钠、乙酸钠、苯丙氨酸可有效促进紫杉醇的生成产量，产量最高可达242.6 g/L[68]。

5 总结与展望

近年来，随着生物化学、分子生物学等学科的不断发展，产GAs的合成途径已逐渐清晰，合成途径中的大部分关键酶基因的功能也都研究得较为深入，但在代谢调控机制方面，前体物代谢调控方面研究不够深入，还有待于进一步探索。本课题组致力于中GA4的前体物代谢调控研究，发现前体物对GA4效价提高有显著影响。

目前GA的生产主要通过液态深层发酵来实现，但GA需求日益增长与工业生产的高成本形成了尖锐的矛盾。因此，一方面可利用代谢工程对GA合成途径进行分子改造，获得GA种类单一、稳产高产的工程菌株；另一方面可通过宏观代谢调控发酵工艺优化方式提高GA产量，具体体现在以下3个方面：1) 转移或构建新的细胞代谢流。通过对基因和基因簇的克隆、定点敲除、同源重组、定向诱变等方式构建新的细胞代谢流，提高GA积累水平。目前，用于GA生产的菌主要是和串珠镰刀菌。随着研究的不断深入，发现甲基营养型芽孢杆菌[69]、解淀粉芽孢杆菌[70]、草螺菌[71]等细菌也能产生GA，但目前能够应用于工业生产的细菌还未见报道。而且除GA外，其他萜类化合物如β-胡萝卜素、青蒿素等均在构建工程菌株展开了深入研究。因此，可以借鉴其他萜类化合物的研究思路作为后续深入探究提升GA产量的新方向。2) 增加GA合成代谢流。一方面可以通过改造和调控微生物内源代谢途径，提高限速酶的表达量。另一方面可以直接在发酵过程中添加前体物，王卫等[69]在培养基中添加L-异亮氨酸、草酰乙酸、MVA等合成前期的小分子物质，较添加单一前体MVA，GA3产量提高了11.6%。目前通过该方面进行调控GA产量的研究相对较少可进行深入探究。3) 发酵工艺优化。首先可以通过分析中GA代谢调控机制，微观为思路，宏观为导向，对菌株最适生长条件进行优化；其次创新开发新型的发酵方式，满足GA的商业需求。

[1] Shen Q, Liu YY, Naqvi NI. Fungal effectors at the crossroads of phytohormone signaling. Curr Opin Microbiol, 2018, 46: 1–6.

[2] Rodrigues C, de Souza Vandenberghe LP, Oliveira JD, et al. New perspectives of gibberellic acid production: a review. Crit Rev Biotechnol, 2012, 32(3): 263–273.

[3] Hedden P, Thomas SG. Gibberellin biosynthesis and its regulation. Biochem J, 2012, 444(1): 11–25.

[4] Bömke C, Tudzynski B. Diversity, regulation, and evolution of the gibberellin biosynthetic pathway in fungi compared to plants and bacteria. Phytochemistry, 2009, 70(15/16): 1876–1893.

[5] Peng H, Shi TQ, Nie ZK, et al. Fermentative production of gibberellins: a review. Chem Ind Eng Progr, 2016, 35(11): 3611–3618 (in Chinese). 彭辉, 施天穹, 聂志奎, 等. 微生物发酵产赤霉素的研究进展. 化工进展, 2016, 35(11): 3611–3618.

[6] Li QX, Zhang L, Wang Y, et al. The research progress of gibberellin on the regulation of flowering and floral organ development in plant. Chin J Cell Biol, 2019, 41(4): 746–758 (in Chinese).李巧峡, 张丽, 王玉, 等. 赤霉素调控植物开花及花器官发育的研究进展. 中国细胞生物学学报, 2019, 41(4): 746–758.

[7] Al-Aboudi A, Kana’An BM, Zarga MA, et al. Fungal biotransformation of diuretic and antihypertensive drug spironolactone with,,, and. Steroids, 2017, 128: 15–22.

[8] Kawaide H. Biochemical and molecular analyses of gibberellin biosynthesis in fungi. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(3): 583–590.

[9] Nett RS, Montanares M, Marcassa A, et al. Elucidation of gibberellin biosynthesis in bacteria reveals convergent evolution. Nat Chem Biol, 2017, 13(1): 69–74.

[10] Nagel R, Peters RJ. Investigating the phylogenetic range of gibberellin biosynthesis in Bacteria. Mol Plant Microbe Interact, 2017, 30(4): 343–349.

[11] Escamilla SEM, Dendooven L, Magaña IP, et al. Optimization of gibberellic acid production by immobilizedmycelium in fluidized bioreactors. J Biotechnol, 2000, 76(2/3): 147–155.

[12] Zhang WX, Liu YX, Zhou JL, et al. The fermentation technology conditions of pilot plant for gibberellin A4+A7in 5000 L tank. Agrochemicals, 2011, 50(11): 805–807 (in Chinese). 张文宣, 刘义雄, 周金龙, 等. 赤霉素GA4+7在5000L发酵罐中的中试发酵工艺. 农药, 2011, 50(11): 805–807.

[13] Tudzynski B. Biosynthesis of gibberellins in: biomolecular aspects. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 52(3): 298–310.

[14] Tudzynski B. Gibberellin biosynthesis in fungi: genes, enzymes, evolution, and impact on biotechnology. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(6): 597–611.

[15] Salazar-Cerezo S, Martínez-Montiel N, García-Sánchez J, et al. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiol Res, 2018, 208: 85–98.

[16] Rojas MC, Hedden P, Gaskin P, et al. Thegene ofencodes a multifunctional enzyme in gibberellin biosynthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(10): 5838–5843.

[17] Tudzynski B, Rojas MC, Gaskin P, et al. The gibberellin 20-oxidase ofis a multifunctional monooxygenase. J Biol Chem, 2005, 277(24): 21246–21253.

[18] Zhang XW, Zhang D. Recent advances of secondary metabolites in genus. Plant Physiol J, 2013, 49(3): 201–216 (in Chinese). 张晓伟, 张栋. 镰孢菌属真菌次生代谢产物的研究进展. 植物生理学报, 2013, 49(3): 201–216.

[19] Giordano W, Avalos J, Fernández-Martín R, et al. Lovastatin inhibits the production of gibberellins but not sterol or carotenoid biosynthesis in. Microbiology, 1999, 145(10): 2997–3002.

[20] Li L, Hu CH. Advance in fungal diterpene cyclase-A review. Acta Microbiol Sin, 2010, 50(11): 1438–1445 (in Chinese).刘莉, 胡昌华. 真菌二萜环化酶的研究进展. 微生物学报, 2010, 50(11): 1438–1445.

[21] Albermann S, Linnemannstöns P, Tudzynski B. Strategies for strain improvement in: overexpression and localization of key enzymes of the isoprenoid pathway and their impact on gibberellin biosynthesis. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(7): 2979–2995.

[22] Keasling JD. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabol Eng, 2012, 14(3): 189–195.

[23] Tudzynski B, Hölter K. Gibberellin biosynthetic pathway in: evidence for a gene cluster. Fungal Genet Biol, 1998, 25(3): 157–170.

[24] Davis EM, Croteau R. Cyclization enzymes in the Biosynthesis of monoterpenes, sesquiterpenes, and diterpenes//Leeper FJ, Vederas JC, eds. Biosynthesis. Berlin: Springer, 2000, 209: 53–95.

[25] Domenech CE, Giordano W, Avalos J, et al. Separate compartments for the production of sterols, carotenoids and gibberellins in. Eur J Biochem, 1996, 239(3): 720–725.

[26] Tudzynski B, Mihlan M, Rojas MC, et al. Characterization of the final two genes of the gibberellin biosynthesis gene cluster of:andencode GA4desaturase and the 13-hydroxylase, respectively. J Biol Chem, 2003, 278(31): 28635–28643.

[27] Tudzynski B, Hedden P, Carrera E, et al. Thegene ofencodes-kaurene oxidase in the gibberellin biosynthesis pathway. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(8): 3514–3522.

[28] Zhuang MK, Wang JG, Ji ZX, et al. Effects of vegetable oils on ferment of gibberellin acid. J Chin Cereals Oils Assoc, 2008, 23(1): 77–80 (in Chinese). 庄木坤, 王继刚, 冀志霞, 等. 植物油对赤霉酸发酵的影响及其分析. 中国粮油学报, 2008, 23(1): 77–80.

[29] Mihlan M, Homann V, Liu TW, et al.directly mediates nitrogen regulation of gibberellin biosynthesis in, but its activity is not affected by. Mol Microbiol, 2010, 47(4): 975–991.

[30] Teichert S, Schőnig B, Richter S, et al. Deletion of theglutamine synthetase gene has significant impact on transcriptional control of primary and secondary metabolism. Mol Microbiol, 2004, 53(6): 1661–1675.

[31] Shen K, Wang JJ, Tong YM, et al. Cloning and functional analysis of StAC gene in. Sci Agric Sin, 2013, 46(5): 881–888 (in Chinese). 申珅, 王晶晶,佟亚萌, 等. 玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因的克隆与功能分析. 中国农业科学, 2013, 46(5): 881–888.

[32] Lengeler KB, Davidson RC, D’Souza C, et al. Signal transduction cascades regulating fungal development and virulence. Microbiol Mol Biol Rev, 2000, 64(4): 746–785.

[33] Michielse CB, Studt L, Janevska S, et al. The global regulatoris required for expression of secondary metabolite gene clusters but not for pathogenicity in. Environ Microbiol, 2015, 17(8): 2690–2708.

[34] García-Martínez J, Ádám AL, Avalos J. Adenylyl cyclase plays a regulatory role in development, stress resistance and secondary metabolism in. PLoS ONE, 2012, 7(1): e28849.

[35] Studt L, Humpf HU, Tudzynski B. Signaling governed by G proteins and cAMP is crucial for growth, secondary metabolism and sexual development in. PLoS ONE, 2013, 8(2): e58185.

[36] Wiemann P, Albermann S, Niehaus EM, et al. The Sfp-type 4′-phosphopantetheinyl transferase ppt1 ofcontrols development, secondary metabolism and pathogenicity. PLoS ONE, 2012, 7(5): e37519.

[37] González PC, Delgado G, Antigua M, et al. Some Aspects ofCulture Concerning Gibberellic Acid Production//Galindo E, Ramírez OT, eds. Advances in Bioprocess Engineering. Dordrecht: Springer, 1994: 425–430.

[38] Liu WF, Zhao XY, Tian YJ, et al. Fermentation conditions for gibberellin production by aSFGi-1 strain. China Brew, 2010, 29(6): 117–120 (in Chinese). 刘文芳, 赵祥颖, 田延军, 等. 菌株SFGi-1产赤霉素发酵条件的研究. 中国酿造, 2010, 29(6): 117–120.

[39] Liu FL, Bai J, Li P, et al. Research on solid-state fermentation medium for gibberellin. Guangdong Chem Ind, 2018, 45(8): 38, 19 (in Chinese). 刘风莉, 白净, 李攀, 等. 赤霉素固态发酵培养基的研究. 广东化工, 2018, 45(8): 38, 19.

[40] Liu WF. Study on the formentation conditions of gibberellins produced by the strain SFGi-1[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2010: 32–35 (in Chinese).刘文芳.菌株SFGi-1产赤霉素发酵条件的研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2010: 32–35.

[41] Park YS, Momose I, Tsunoda K, et al. Enhancement of cephamycin C production using soybean oil as the sole carbon source. Appl Microbiol Biotechnol, 1994, 40(6): 773–779.

[42] Chen GB, Qi W, Guo B, et al. Study on the cephanmycin C production using soybean oil as the part carbon source. J Tianjin Inst Light Ind, 1998, (2): 1–5 (in Chinese). 陈贵斌, 戚薇, 郭波, 等. 油为部分碳源发酵生产头霉素C的初步研究. 天津轻工业学院学报, 1998, (2): 1–5.

[43] Yang LF, Cao J, Zhang ZZ, et al. Effect of vegetable oils on the erythromycin fermentation. Food Ferment Technol, 2009, 45(4): 46–48 (in Chinese).杨莲芳, 曹健, 张中州, 等. 不同种类植物油对红霉素发酵的影响. 食品与发酵科技, 2009, 45(4): 46–48.

[44] Wong KH, Hynes MJ, Todd RB, et al. Transcriptional control ofby the bZIP transcription factor MeaB reveals a new level of nitrogen regulation in. Mol Microbiol, 2010, 66(2): 534–551.

[45] Wagner D, Schmeinck A, Mos M, et al. The bZIP transcription factorB mediates nitrogen metabolite repression at specific loci. Eukaryot Cell, 2010, 9(10): 1588–1601.

[46] Wang W, Wu YH, Li JL, et al. Enhanced gibberellic acid production through the regulation of temperature in batch fermentation. Chin J Appl Environ Biol, 2017, 23(3): 432–436 (in Chinese). 王卫, 吴耀辉, 黎继烈, 等. 温度对赤霉素发酵的影响及优化策略. 应用与环境生物学报, 2017, 23(3): 432–436.

[47] Wang W. Screening high gibberellin acid producing strains formand optimization on the fermentation conditions[D]. Changsha: Central South University of Forestry and Technology, 2015: 47–48 (in Chinese). 王卫. 高产赤霉素菌株选育及发酵工艺优化[D]. 长沙:中南林业科技大学, 2015: 47–48.

[48] Li MS, Han YL, Zhao XY, et al. Optimizing the gibberellin solid fermentation conditions ofGLV-85. Shandong Food Ferm, 2012, (1): 3–8 (in Chinese). 李明森, 韩延雷, 赵祥颖, 等. 菌株GLV-85产赤霉素固体发酵条件的研究. 山东食品发酵, 2012, (1): 3–8.

[49] Lale G, Gadre R. Enhanced production of gibberellin A4(GA4) by a mutant ofin wheat gluten medium. J Ind Microbiol Biotechnol, 2010, 37(3): 297–306.

[50] Chu XY, Yin TS, Tang YH. Study on trace element additives in stimulating GA secretion and the rapid method for GA determination. Guangdong Trace Elements Sci, 1995, 2(6): 1–7 (in Chinese).储修云, 印天寿, 唐玉华. 微量元素添加剂促进赤霉素分泌及赤霉素速测技术研究. 广东微量元素科学, 1995, 2(6): 1–7.

[51] Li MS. Study on fermentation and extraction process for GA3[D]. Ji’nan: Shandong Polytechnic University, 2012: 8.李明森. 赤霉素发酵及提取工艺的研究[D]. 济南: 山东轻工业学院, 2012: 8.

[52] Xie SH, Yu XB, Gu QY. Enhancement of lycopene production by blakeslea trispora using carotenoid biosynthetic enzyme promoter. Chin J Biopr Eng, 2008, 6(2): 17–21 (in Chinese).解书怀, 余晓斌, 顾秋亚. 代谢途径酶活促进剂对番茄红素发酵的影响. 生物加工过程, 2008, 6(2): 17–21.

[53] Bilkay IS, Karakoç Ş, Aksöz N. Indole-3-acetic acid and gibberellic acid production in Aspergillus niger. Turkish J Biol, 2010, 34(3): 313–318.

[54] Zhang WX, Liu YX, Zhou SJ, et al. Study of replacing calcium carbonate with ammonium feeding in gibberellins A4+7fermentation. World Pesticid, 2011, 33(6): 48–51 (in Chinese). 张文宣, 刘义雄, 周圣骄, 等. 流加补氨水代替碳酸钙在赤霉素GA4＋7生物发酵中的研究. 世界农药, 2011, 33(6): 48–51.

[55] Kahlon SS, Malhotra S. Production of gibberellic acid by fungal mycelium immobilized in sodium alginate. Enzyme Microb Technol, 1986, 8(10): 613–616.

[56] Bandelier S, Renaud R, Durand A. Production of gibberellic acid by fed-batch solid state fermentation in an aseptic pilot-scale reactor. Proc Biochem, 1997, 32(2): 141–145.

[57] Uthandi S, Karthikeyan S, Sabarinathan KG. Gibberellic acid production bySG2. Journal of Scientific and Industrial Research, 2010, 69: 211–214.

[58] Berrios J, Pyle DL, Aroca G. Gibberellic acid extraction from aqueous solutions and fermentation broths by using emulsion liquid membranes. J Membr Sci, 2010, 348(1/2): 91–98.

[59] Jefferys EG. The gibberellin fermentation. Adv Appl Microbiol, 1970, 13: 283–316.

[60] Meleigy SA, Khalaf MA. Biosynthesis of gibberellic acid from milk permeate in repeated batch operation by a mutantmoniliforme cells immobilized on loofa sponge. Bioresour Technol, 2009, 100(1): 374–379.

[61] Borrow A, Jefferys EG, Kessell RHJ, et al. The metabolism ofin stirred culture. Can J Microbiol, 1961, 7(2): 227–276.

[62] Machado CM, Oishi BO, Pandey A, et al. Kinetics ofgrowth and gibberellic acid production by solid-state fermentation in a packed-bed column bioreactor. Biotechnol Prog, 2010, 20(5): 1449–1453.

[63] Wiemann P, Brown DW, Kleigrewe K, et al. FfVel1 and FfLae1, components of a velvet-like complex in, affect differentiation, secondary metabolism and virulence. Mol Microbiol, 2010, 77(4): 972–994.

[64] Miura Y, Kondo K, Shimada H, et al. Production of lycopene by the food yeast,that does not naturally synthesize carotenoid. Biotechnol Bioeng, 1998, 58(2/3): 306–308.

[65] Shimada H, Kondo K, Fraser PD, et al. Increased carotenoid production by the food yeastthrough metabolic engineering of the isoprenoid pathway. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(7): 2676–2680.

[66] Cihangir N. Stimulation of the gibberellic acid synthesis byin submerged culture using a precursor. World J Microbiol Biotechnol, 2002, 18(8): 727–729.

[67] Wang W, Li JL, Shen JJ, et al. Selection of precursors for producing gibberellin acid byand optimization of the fermentation process. Chin J Pharmaceut, 2016, 47(6): 692–695 (in Chinese). 王卫, 黎继烈, 沈珺珺, 等. 赤霉素发酵前体的筛选与发酵工艺优化. 中国医药工业杂志, 2016, 47(6): 692–695.

[68] Dai WL, Cheng L, Tao WY. Application of response surface methodology in optimization of precursors for taxol production byK178. China Biotechnol, 2007, 27(11): 66–72 (in Chinese). 代文亮, 程龙, 陶文沂. 响应面法在紫杉醇产生菌发酵前体优化中的应用. 中国生物工程杂志, 2007, 27(11): 66–72.

[69] Radhakrishnan R, Lee IJ. Gibberellins producingKE2 supports plant growth and enhances nutritional metabolites and food values of lettuce. Plant Physiol Biochem, 2016, 109: 181–189.

[70] Shahzad R, Waqas M, Khan AL, et al. Seed-borne endophyticRWL-1 produces gibberellins and regulates endogenous phytohormones of. Plant Physiol Biochem, 2016, 106: 236–243.

[71] Lee KE, Radhakrishnan R, Kang SM, et al. Enterococcus faecium LKE12 cell-free extract accelerates host plant growth via gibberellin and indole-3-acetic acid secretion. J Microbiol Biotechnol, 2015, 25(9): 1467–1475.

Research progress in biosynthesis and metabolism regulation of gibberellins in

Bingxuan Wang1, Wen Si3, Yefei Wu3, Xinqi Zhang1, Shiying Wang1, Choufei Wu2, Haiping Lin1, and Lianghong Yin1

1,,’311300,,2,,313000,,Zhejiang Qianjiang Biochemical CoLtdHainingZhejiangChina

Gibberellin is one of the most important plant growth regulators, and widely used in agricultural production. However, the high cost of gibberellins production is restricting its efficient application. In recent years, biotechnological innovations have improved the synthesis of gibberellin. Gibberellin biosynthesis requires various enzymes. Current research focuses on the biosynthetic mechanisms of gibberellin and the metabolic engineering techniques to improve the production of gibberellin. This paper reviews the current research on gibberellin biosynthesis pathway, the key and enzymes environmental factors involved, and the metabolic regulation of gibberellin in, summarizes the application of metabolic regulation in gibberellin biosynthesis, to provide the basis for achieving stable gibberellins production.

, gibberellins, biosynthesis, metabolic regulation, key enzyme

王冰璇, 司文, 吴烨飞, 等.藤仓赤霉菌赤霉素生物合成及代谢调控研究进展. 生物工程学报, 2020, 36(2): 189–200.

Wang BX, Si W, Wu YF, et al. Research progress in biosynthesis and metabolism regulation of gibberellins in. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 189–200.

May14, 2019;

July25, 2019

Supported by: Sub-project of National Key Research and Development Program (No. 2017YFD0201302-04), Collabrative Innovation Center of Zhejiang Green Pesticide Open Fund Programs (No. LSNY201815).

Haiping Lin. Tel: +86-571-63732757; Fax: +86-571-63740809; E-mail: zjlxylhp@163.comLianghong Yin. Tel:+86-571-63732757; E-mail: ylh4@163.com

10.13345/j.cjb.190194

国家重点研发计划 (No. 2017YFD0201302-04)，浙江省绿色农药2011协同创新中心开放基金 (No. LSNY201815) 资助。

2019-08-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190805.1053.001.html

(本文责编 郝丽芳)