血清miR-15b、miR-29a和CysC在妊娠高血压疾病肾脏损害中的临床诊断价值

朱怡，秦艳，何珏

妊娠高血压疾病(HDCP)是妇科常见病，一般发生在妊娠20周左右，常常伴有并发症的发生，发生率在9.4%～10.4%[1-2]，首先出现受累的器官是肾脏，也是威胁孕妇和围产儿安全的重要因素，其病死率高达27.5%[3]。因此，早期发现和诊断妊娠高血压肾功能损害，早期干预和治疗是改善妊娠结局的关键。胱抑素C(CysC)是具有早期诊断肾功能损伤的指标，但单个指标的敏感度和特异度仍不高[4-5]。微小RNAs(miRNAs)是人体内的一种19～25个核苷酸的RNAs，在妊娠高血压和肾功能损害的发生发展过程中具有重要的作用。现已知在急性肾损伤的研究中发现外周血miR-29a表达明显降低，而在HDCP中的研究较少[6]；miR-15b在血管的形成过程中具有重要意义，是否与HDCP患者肾功能损害具有相关性，仍不清楚。本研究通过联合检测HDCP患者血清miR-15b、miR-29a和CysC水平，观察其在HDCP发生发展和肾功能损害中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2018年12月在上海中医药大学附属第七人民医院妇产科诊治的HDCP患者108例作为HDCP组，平均年龄22～38(29.34±3.75)岁；平均孕周28～36(32.94±1.38)周；平均孕次1～3(2.15±0.17)次；初产妇39例，经产妇69例。根据病情的严重程度分为妊娠高血压组39例，子痫前期轻度组35例，子痫前期重度组34例。根据HDCP患者肾小球滤过率(eGFR)分为肾功能正常组(eGFR≥80 ml/min)67例和肾功能异常组(eGFR<80 ml/min)41例，肾功能异常组根据KDIGO制定急性肾损伤标准分为1期17例，2期13例和3期11例。同时选择同期正常妊娠在医院行产前体检孕妇30例为正常妊娠组，孕周28～36(31.86±1.26)周；年龄22～38(29.81±4.38)岁；孕次1～3(2.09±0.24)次；初产妇12例和经产妇18例。选择同期在医院行健康体检女性30例为健康对照组，其年龄22～38(28.94±5.16)岁。HDCP组排除标准：冠心病、糖尿病和原发性高血压等慢性疾病；免疫性和肿瘤性疾病；肝炎、结核和肺部感染等急性和慢性感染；内分泌和血液性疾病。3组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，入选者或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测指标与方法

1.2.1 血液标本采集和指标检测：采集患者入院后、体检者当日清晨空腹肘静脉血10 ml，在4℃的条件下放置30 min，1 800 r/min离心20 min，取上清液，将其保存在-70℃冰箱中待测。采用酶联免疫吸附试验测定CysC和β2-MG。

1.2.2 miRNA提取和逆转录反应：根据miRNeasy提取试剂盒的说明书提取miRNA，并通过紫外分光度计将吸光度比值在1.8～2.0之间的标本保存用于后续检测，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反转录试剂盒的使用说明书将miRNA反转录为cDNA，标本保存在-70℃的冰箱中。

1.2.3 qRT-PCR检测：根据GenBank中的miR-15b、miR-29a和U6的序列号，并用Premier Primer5.0软件进行引物设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-15b引物序列：上游5’-GCCGGCTAGCAGCACATCATGG-3’，下游5’-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3’； miR-29a的引物序列：上游5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATCTGAA-3’，下游5’-CTCAACTGGTGTGGTGGA-3’；U6引物序列：上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。qRT-PCR的总反应体系为25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(其浓度为10 μmol/L)，cDNA为0.8 μl，RNaseH2O为12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM10 ml。反应条件为：预变性温度95℃10 min，95℃和60℃分为5 s和60 s，总共进行40个循环。在60℃下用ABI7700软件收集荧光信号进行溶解曲线分析，每个样品进行3个平行复孔，相对表达量采用2-ΔΔCt，公式中ΔΔCt=试验组(Ct目标基因-CtU6)-对照组(Ct目标基因-CtU6)。

2 结 果

2.1 各组血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比较 HDCP组血清miR-15b、CysC和β2-MG水平明显高于正常妊娠组、健康对照组(P<0.01)，正常妊娠组高于健康对照组(P<0.01)；而HDCP组血清miR-29a表达水平明显低于正常妊娠组和健康对照组(P<0.01)，正常妊娠组明显低于健康对照组(P<0.01)，见表1。

2.2 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平与HDCP严重程度的关系 血清miR-15b、CysC和β2-MG水平随着HDCP严重程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-29a表达水平随着HDCP严重程度升高而降低(P<0.01)，见表2。

2.3 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平与肾功能损害的关系 HDCP患者肾功能异常亚组血清miR-15b、CysC和β2-MG水平明显高于肾功能正常亚组(P<0.01)，而血清miR-29a表达水平明显低于肾功能正常亚组(P<0.01)，见表3。

2.4 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平与HDCP肾功能损害严重程度的关系 HDCP肾功能异常组血清miR-15b、CysC和β2-MG水平随着肾功能分期升高而升高(P<0.01)，而血清miR-29a表达水平随着肾功能分期升高而降低(P<0.01)，见表4。

表1 各组血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比较

注：与健康对照组比较，aP<0.01；与正常妊娠组比较，bP<0.01

表2 不同HDCP严重程度患者血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比较

注：与妊娠高血压亚组比较，aP<0.01；与子痫前期轻度亚组比较，bP<0.01

表3 不同肾功能损害患者血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比较

表4 不同HDCP肾功能分期患者血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比较

注：与1期比较，aP<0.01；与2期比较，bP<0.01

2.5 血清miR-15b、miR-29a和CysC、β2-MG诊断HDCP肾功能损害的效能 血清miR-15b，miR-29a和CysC表达水平诊断HDCP肾功能损害的效能明显高于β2-MG(z=2.391，P<0.01；z=2.285，P<0.05；z=2.276，P<0.05)，而各指标之间差异无统计学意义(P>0.05)。对血清miR-15b、miR-29a和CysC进行二元Logistic回归分析，发现联合检测(miR-15b、miR-29a和CysC)的AUC为0.993，敏感度为95.1%，特异度为100%，明显优于单个指标miR-15b(z=2.744，P<0.01)、miR-29a(z=3.590，P<0.01)和CysC(z=3.151，P<0.01)的检测，见表5、图1。

3 讨 论

HDCP是妊娠期妇女特有的疾病，其发病机制仍不完全清楚， HDCP患者出现全身小血管痉挛、动脉血压升高，引起其他脏器灌注不足，而脏器灌注不足导致病理生理改变，常常危及孕妇和围产儿的安全。最常累及的器官为肾脏，常引起肾脏损害和肾功能障碍。血肌酐和蛋白尿的检测常运用于肾损伤的诊断和病情判断，但由于其敏感度低，影响对病情的判断。β2-MG是用于判断肾损伤的常见指标，由于其敏感度和特异度仍不高，逐渐被其他检测指标所替代[7]。本研究发现，HDCP组血清CysC水平明显高于正常妊娠组和健康对照组，并且随着HDCP病情严重程度的加重而升高，说明CysC参与了HDCP的发生发展过程，是反映HDCP病情的重要指标。本研究还发现，HDCP肾功能异常患者血清CysC水平明显高于肾功能正常组，并且随着肾功能分期进展而升高，说明CysC也是反映HDCP肾脏损害程度的重要指标，与以往文献报道结果类似[8]。CysC是一种相对分子量较小的非糖化多肽链，在体内稳定存在，不受性别、年龄和饮食结构的影响，肾小球的滤过功能与血清CysC水平密切相关，轻微的肾小球损害即会引起血清CysC水平的升高，是诊断急性肾损伤的有效指标[9-10]。本研究发现CysC在诊断肾脏损伤的效能方面明显优于β2-MG，当其>1.832 mg/L，其敏感度68.3%，特异度94.0%，AUC为0.897，说明在诊断HDCP肾损伤方面具有较高的敏感度和特异度。

miRNAs是一类长度为20个核苷酸左右的RNA分子，属于非编码RNA，无法翻译形成蛋白质，但对DNA的转录具有调控作用。随着对miRNAs的深入研究，其与妊娠和循环系统疾病的发生发展具有密切联系，越来越多的研究表明，miRNAs与妊娠相关性病变具有密切联系，同时参与了心血管疾病的发生发展过程[11]。本研究发现，HDCP组血清miR-15b表达水平明显高于正常妊娠组和健康对照组，并且随HDCP严重程度升高而升高，说明miR-15b参与了HDCP疾病的发生发展过程。现已知miR-15b位于3q25.33，在一项缺血再灌注损伤的研究中发现，其在心肌细胞中的表达明显出现上调，并发现miR-15b通过抑制Bcl-2蛋白的表达，促进细胞的凋亡[12]。在心血管疾病的研究中发现，miR-15b通过使线粒体变性，导致细胞ATP水平下降，从而影响心肌的代谢，并认为miR-15b参与了心血管病变的发生发展过程[13]。妊娠期高血压是否对miR-15b表达有影响，尚未见文献报道。本研究证实HDCP肾功能异常组血清miR-15b表达明显高于肾功能正常组，并且随着肾功能分期升高而升高，说明miR-15b在肾功能损害的过程中具有重要作用。在诊断肾功能损害的效能方面，当血清miR-15b>2.697，其敏感度为85.4%，特异度85.1%，AUC为0.904，明显优于β2-MG，说明miR-15b表达水平在诊断HDCP肾功能损害具有较高效能。

表5 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG在诊断HDCP肾功能损害的效能

miR-29a是miR-29家族中的一员，在纤维化疾病中研究较多，主要在心肌梗死后纤维化、全身动脉硬化和肺纤维化等疾病中起到抗纤维化的作用[14-17]，是多种细胞外胶原合成的关键因子，对胶原蛋白的合成起到抑制作用。而在妊娠高血压疾病中的研究未见报道[18-19]。本研究还发现，HDCP肾功能异常患者血清miR-29a表达水平明显低于肾功能正常组，并且随着肾功能分期升高而降低，说明miR-29a是肾功能异常的保护因子。在诊断HDCP肾功能异常的效能方面，当血清miR-29a表达水平≤1.031，其敏感度为80.5%，特异度为86.6%，AUC为0.888，说明miR-29a表达水平对HDCP肾功能损伤具有较高的诊断效能。本研究通过联合miR-15b、miR-29a和CysC检测，发现其AUC为0.993，明显高于单个指标的检测，并且说明各个指标诊断HDCP肾功能损害具有一定的互补性，但其确切的机制仍需进一步研究。

总之，miR-15b、miR-29a和CysC参与了妊娠高血压疾病肾脏损害的发生发展过程，联合miR-15b、miR-29a和CysC指标诊断HDCP肾损害具有较高的敏感度和特异度。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

朱怡：设计研究方案，实施研究过程，统计学分析，论文撰写；秦艳：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;何珏：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改