水凝胶在软骨组织工程中的设计与应用进展

易鹏综述 邱波审校

软骨缺损的修复、再生是医学研究难题和热点之一，组织工程已成为软骨和骨组织重建和再生最常用的方法之一[1]。组织工程主要有2种方法再生缺损的骨软骨界面和全层软骨。一种是开发人造软骨以模拟天然软骨组织的结构特征、机械特性，从而模拟其生物功能。然而，模拟组织和结构高度复杂的关节软骨和骨软骨界面组织的独特生物功能仍然是一个挑战。另一种为再生医学，即提供适当的生物材料作为人工细胞外基质，以促进缺损部位的细胞生长、增殖和分化，利用细胞和生物分子之间相互作用的天然生物过程促进关节软骨和软骨下骨的再生[2]。

水凝胶是用于组织工程中一种多功能的生物材料，具有与天然细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相似的独特性质。理想的水凝胶支架应该具备良好的生物相容性、生物降解性、机械性能、细胞黏附性，合适的支架孔径、孔隙率，容易制造和可注射微创治疗等特点。但迄今为止尚未研究出一种理想的水凝胶支架。现就水凝胶的材料选择、性质优化及水凝胶支架设计的最新进展进行综述。

1 水凝胶材料概述

1.1 天然生物材料 天然材料含量丰富，由天然聚合物制成的水凝胶通常具有良好的生物相容性、生物降解性和低免疫反应性。用于制备水凝胶支架的天然材料主要包括蛋白质类如胶原蛋白、明胶和丝素蛋白，多糖类如海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸和结冷胶等。

胶原蛋白是细胞外基质中最丰富的结构蛋白成分，约90%的关节软骨干重是Ⅱ型胶原。胶原蛋白具有优异的生物学特性，但其机械性能较差[3]。明胶是胶原蛋白的水解产物，由许多促进细胞黏附的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)序列和促进细胞重塑的基质金属蛋白酶(MMP)靶序列组成。明胶溶液可以在低温(<30°C)条件下自凝胶化形成物理交联水凝胶或通过化学反应形成化学交联水凝胶[4]。丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，由于其强大的机械性能，优异的生物相容性，缓慢的降解性和丰富的供应来源，已成为组织工程应用的新型生物材料[5]。

藻酸盐是天然存在的多糖聚合物之一，通常从棕色海藻和各种细菌中获得。藻酸盐的一个独特性质是能够在室温下通过二价阳离子如Ca2+进行物理交联[6]。琼脂糖是一种海藻多糖，具有优异生物相容性和生物力学性质。壳聚糖是一种线性多糖，衍生自天然几丁质，由葡糖胺和N-乙酰葡糖胺组成。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，其独特的细胞黏附性在水凝胶设计中发挥重要作用。透明质酸由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的二糖单元组成的线性多糖，其较弱的机械性能、较高的膨胀性能、光滑表面结构及不抗酶解等制约了其在组织工程学上的应用。结冷胶是一种线性阴离子多糖，由四糖重复单元组成。结冷胶水凝胶具有独特的可注射性，其凝胶化过程可以通过温度变化和阳离子的存在来调节，而无需复杂的化学交联剂[7]。

1.2 人工合成材料 虽然天然生物材料制备的水凝胶对软骨形成、细胞生长、增殖和表型维持显示出优异的生物相容性，但较弱的机械性质和不受控制的降解性限制了它们在软骨组织工程中的应用。用于制备水凝胶支架的人工合成材料主要包括无机高分子材料如β-磷酸三钙和有机高分子材料如聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)和聚羟基乙酸(PGA)及它们的共聚物等。人工合成材料制成的水凝胶由于其化学结构和分子组成便于调节，表现出高度可调的生物降解性和机械性质等。

2 水凝胶特性

2.1 生物相容性 通常合成生物材料的生物相容性比较差，该问题最常见的解决策略是改变合成生物材料的性质或与天然生物材料组合。此外，通过交联或者改变材料本身的性质也能够改善支架生物相容性，如利用聚合物上的共轭方式或离子电荷[8]。研究发现，阳离子的存在会对水凝胶的生物相容性产生不利影响，用负电荷可以增强D-寡肽水凝胶的生物相容性[9]。将胶原—壳聚糖多孔支架与γ-辐射和碳二亚胺(CAR)交联，利用静电纺丝技术制备壳聚糖—明胶复合支架也可以提高支架的生物相容性[10]。

支架材料的生物相容性越来越受到重视，因为支架最终需与临床结合，无论是体外培养细胞或者植入人体内，支架性质必须有效且安全。设计出完美的生物相容性支架是实现有效组织工程的最终目标。

2.2 生物降解性 生物降解是指材料在生物体内通过溶解、酶解、细胞吞噬等作用，在组织长入的过程中不断从体内排出，修复后的组织完全替代植入材料的位置，而材料在体内不存在残留的性质。控制水凝胶的生物降解性以匹配细胞生长和组织修复的速率对于合理设计水凝胶至关重要。研究发现降解过快可能导致ECM蛋白的保留减少，而降解过慢会阻碍细胞重塑，从而阻碍组织的形成，具有平衡生物降解速率的水凝胶能够促进细胞新软骨的形成，并在长期培养后获得更高的机械性能[11]。

2.3 机械性能 水凝胶具有宏观和微观水平的机械性质。在宏观上支架必须承受负荷，以在组织形成时为组织提供稳定性并实现维持其体积的功能。在微观上，黏附在基质上的细胞能够感知机械刺激，从而以类似生化信号的方式调节许多重要的生理过程。因此，支架必须能够承受特定的负荷并以适当的方式将它们传递给周围的细胞和组织。Wang等[12]将软骨细胞植入明胶—羟苯基丙酸(Gtn-HPA)水凝胶进行体外和体内培养，结果表明，水凝胶刚度可以调节软骨细胞的功能，影响硫酸化糖胺聚糖的产生、Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因表达，合适的机械性能更好地维持软骨细胞表型和更高程度的透明样软骨修复。将水凝胶刚度纳入软骨组织工程支架的设计变量是控制软骨细胞增殖和产生细胞外基质的简单且有效的手段。

2.4 支架结构 合适的孔径可以促进细胞穿透和迁移、营养物扩散和代谢物质去除，并提供诱导细胞组装和分化的3D微环境。多孔结构对于支架与周围环境之间的物质交换是必需的，其能模仿天然软骨的结构，此外还能允许周围组织向内生长进入构建体，从而使构建体与天然组织整合。

2.5 细胞黏附性 良好的细胞黏附性可以促进软骨细胞或间充质干细胞的附着、增殖、分化。细胞黏附参与调节细胞分化、细胞周期、细胞迁移和细胞存活。细胞与底物的亲和力是水凝及支架设计和开发中的重要考虑因素。引入天然多糖、无机纳米粒子或者细胞黏附肽均可以有效增强水凝胶的细胞黏附性。

2.6 可注射性 水凝胶的可注射性已经吸引了软骨组织工程应用的广泛关注，因为可注射水凝胶能够用微创注入法注入手术部位，并且形成任何期望的形状，以匹配不规则的软骨缺陷。制备可注射水凝胶可以使用物理方法或化学方法。物理水凝胶可响应温度，pH或离子浓度的变化，化学水凝胶可通过各种化学过程形成，例如酶交联、Schiff碱交联、Michael加成、点击化学和光交联等。

3 水凝胶特性在软骨组织工程中的应用

软骨组织工程学是工程学与生物医学尤其是细胞生物学相结合的边缘科学，它涉及细胞、支架材料和包括多种生长因子在内的发育环境3种基本要素。

组织工程软骨的构建需要具备3个主要条件：(1)足够数量、功水凝胶特性能正常的种子细胞;(2)合适的细胞支架;(3)调节细胞增殖、保持细胞表型特征的细胞因子 。

为改善人工合成材料的生物相容性，倪茂君等[13]采用辐射交联与冻融循环相结合的方法，将胶原引入聚乙烯醇(PVA)/聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)水凝胶制成复合水凝胶支架，其具有均匀分布的三维多孔结构,胶原的添加增大水凝胶网络空间结构，显示出体外细胞存活率的提高。Sheu等[14]开发出一种氧化透明质酸/白藜芦醇(Oxi-HA/Res)水凝胶，相比于氧化透明质酸(Oxi-HA)水凝胶，其软骨细胞活力更强，细胞毒性显著减小，优异的生物相容性能维持软骨细胞表型、增强ECM合成，并促进聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的基因表达。

水凝胶的生物降解性必须匹配细胞生长和组织修复的速率，如果水凝胶降解太慢，则新组织生长受阻，而降解过快，则可能完全丧失机械完整性。Lalitha等[15]利用计算建模研究了可降解水凝胶构建体的动力学，结果显示，通过利用聚合物交联密度和细胞分布的空间异质性，可水解降解的水凝胶可以有效地促进新组织生长。朱飞燕等[16]利用羟乙基脱乙酰壳多糖(GC)/二醛基聚乙二醇(OHC-PEG-CHO)水凝胶研究其降解性能，研究结果证明其降解速率与水凝胶组分浓度有关。过去还有大量研究证实材料的氧化度、浓度、不同组分的配比等均可以用来调节水凝胶的降解特性，未来的研究有必要进一步优化水凝胶配方，并达到针对涉及不同靶向组织的特定应用而设计的最佳降解速率。

水凝胶支架应具有高拉伸和压缩强度，低摩擦系数，可以促进软骨细胞定植和增殖，合成健康的新基质。为了提高水凝胶的机械性质，Shin等[17]将甲基丙烯酸化的结冷胶和明胶进行两步光交联组成双网络(DN)水凝胶，其表现出高达6.9 MPa的压缩破坏应力，接近软骨的强度。与单网络(SN)水凝胶相比，双网络水凝胶表现出更强的接近软骨的机械强度，但是其细胞相容性较差，因此，他们将硬结冷胶微凝胶掺入柔软和富有延展性的明胶水凝胶中制备出微凝胶增强(MR)水凝胶[18]，它们具有更好的机械强度和生物学性质。Coutinho等[19]研究了交联方式对甲基丙烯酸化的结冷胶水凝胶机械性质的影响，发现物理交联方法(温度和阳离子)与化学交联方法(光交联)的结合使结冷胶水凝胶具有高度可调的物理和机械性能，而不影响它们的生物相容性。提示可以组合生理学上相容的交联方法来开发适用于组织工程应用的可调节机械性能水凝胶。Erickson等[20]将低密度和高密度的间充质干细胞(MSC)分别封装在1%、3%和5%(w/v)透明质酸水凝胶中培养，并测定构建体的机械性质和生化分析，结果显示在体外培养9周后，接种高密度MSC的透明质酸水凝胶构建体在动态培养条件下达到1 MPa的压缩模量。动态培养条件确保了间充质干细胞获得最佳营养途径，硫酸化糖胺聚糖和胶原蛋白的形成量比在静态培养中高30%和29%。证实细胞接种密度和培养方式可以改善水凝胶支架的机械性能，更利于基质的沉积。

支架孔径大小在软骨组织工程中的应用存在许多争议，诸多研究结果认为支架孔径与细胞增殖呈正相关，但有研究显示培养期开始时小孔径的支架中细胞数目的相对增加最大，而在培养期结束时，大孔径的支架有利于细胞增殖，提示在体外软骨组织工程的最初步骤中，小支架孔径和低孔隙率的组合是促进软骨形成的有效策略。Nava等[21]利用溶剂浇铸或颗粒浸出技术制造出具有不同孔径和孔隙度的聚乳酸—三亚甲基碳酸酯支架并接种初级牛关节软骨细胞，培养2周，结果显示随着支架孔径和孔隙率的增加，细胞密度显著增加，与其他学者的研究结果基本一致，这些研究认为，细胞数量、DNA含量、GAG和Ⅱ型胶原含量均随支架孔径和孔隙率的增加而增加。然而Nava等[21]和Stenhamre等[22]的结果还发现随支架孔径增加，细胞代谢活性和细胞外基质的合成均显著降低。结果的差异性可能是由于3D培养因素的复杂性，这可能会影响细胞渗透、分配和养分扩散，还可能与支架使用的材料有关。一种比较合理的解释认为支架的大孔径具有较好的营养供应、气体扩散和代谢废物消除特点，但也会使细胞附着和细胞内信号传导减弱，而小孔与此恰恰相反。近期研究通过结合热致相分离技术和淋盐技术成功制备出具有分层纤维和孔径结构的聚乳酸—脱乙酰壳聚糖复合支架，该支架为大孔和微孔高度互连的结构且具有高孔隙率，测试表明这种分层的微观结构不仅有利于蛋白质吸附和细胞黏附增殖，还可改善机械性能和支架完整性，显示出应用于软骨组织工程的前景。

聚乙烯醇(PVA)具有优良的生物相容性、机械强度和韧性，被广泛用于生物医学[23]，然而由于其固有的细胞非黏性限制了细胞生长和与外周组织的整合，研究者采用各种方法来改善其细胞黏附性，Hou等[24]研究了天然多糖和无机纳米粒子对非黏性PVA水凝胶细胞黏附和生长的协同作用[25-26]。结果证实，Fe2O3和羟基磷灰石(nHAP)纳米颗粒对增强聚乙烯醇水凝胶细胞黏附性具有协同作用，透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)组合比单一HA或CS显著增强PVA水凝胶软骨细胞黏附和增殖，同时磁性复合纳米颗粒和多糖在增加软骨细胞黏附和增殖方面也具有协同作用。天然多糖和磁性PVA的复合水凝胶在软骨组织工程的应用中具有巨大潜力。此外，将细胞黏附肽引入水凝胶支架也是一种有效的方法，诸多文献证实，细胞与ECM之间的相互作用对于生物系统是必不可少的，而各种ECM分子含有特定的肽序列，使其能够直接与细胞表面受体结合，最佳序列之一是首先在纤连蛋白中发现的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸序列(RGD)，Re'em等[27]将RGD肽固定在大孔藻酸盐支架上，结果显示支架表现出增强的细胞黏附性，促进了细胞的增殖。

PNIPAAm是一种衍生自聚丙烯酸的反向温度敏感聚合物，在约32℃的临界溶解温度下具有快速相变，Ren等[28]通过原子转移自由基聚合(ATRP)将PNIPAAm与明胶复合，形成在生理温度下产生溶胶—凝胶转变的可注射水凝胶。此外还有离子敏感、应力敏感、pH敏感等多种物理方法可以改变水凝胶的可注射性。Cheng等[29]利用壳聚糖的氨基官能团与葡聚糖醛的醛基在水溶液中的Schiff反应也可制备出可注射的羧甲基壳聚糖—葡聚糖醛(CMC-DA)复合水凝胶。可注射水凝胶更容易填充缺损位点，牢固地附着并与周围天然软骨组织整合，Chen等[30]在辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化氢(H2O2)的作用下通过酶促交联得到羧甲基支链淀粉—酪胺(CMP-TA)和硫酸软骨素—酪胺(CS-TA)缀合物的可注射水凝胶，结果显示软骨细胞的生存和增殖等细胞功能,Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖的表达水平及合成细胞外基质的积累均显著增强。水凝胶良好的可注射性将极大地推动其在软骨组织工程中的应用。

4 小 结

虽然在水凝胶材料选择和制作研究上已取得很大进展，但仍未能制造出一种具有最佳性质的水凝胶实现软骨组织再生。其面临许多问题有待解决，例如，如何将这些方法结合在一种水凝胶支架中？结合这些不同的方法是否会产生冲突？如何设计合理可行的个体化支架以实现可调控范围内性质的最优化？此外，软骨组织工程要重建的是具有复杂生理功能的软骨组织，因此必须形成足够的Ⅱ型胶原蛋白，蛋白聚糖和其他细胞外基质成分，这需要大量软骨细胞来产生足够的ECM，而软骨细胞增殖非常缓慢，在长时间的扩张期间，它们很容易失去其表型并去分化为成纤维细胞[31]。这些问题与挑战也将是未来软骨组织工程研究的方向。