不同工艺对甘草型功能蜂蜜活性成分及抗氧化功能的影响

刘晓华，卢素芳，王肆玖，华 娟，万学济，周 琪，孙仁利

（1.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，湖北 武汉430208；2.武汉市农业科学院水产研究所，湖北 武汉430208；3.武汉市农业科学院，湖北 武汉430065）

甘草为豆科甘草属多年生草本植物，能调和百药，解百毒。我国用蜂蜜来治病，已有数千年的历史，是药食同源的食品之一。《本草纲目》中说：“蜂蜜生则性凉，故能清热；熟则性温，故能补中；甘而平和，故能解毒；柔而濡泽，故能润燥；缓可去急，故能止心、腹及肌肉疮疡之痛；和可致中，故能调和百药而与甘草同功”。

我们认为利用蜜蜂或者生物手段将甘草导入成熟蜂蜜，制成功能蜂蜜——蜜甘草，有较好的开发价值和市场前景。本研究将蜂蜜和甘草提取物进行有效结合，通过体内（蜜酿工艺）和体外（蜜制工艺）2种方法把蜂蜜和甘草提取物结合在一起，制成功能蜂蜜——蜜甘草，并对其功效进行科学客观评价，为蜜甘草的推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

意大利蜜蜂，土耳其蜂箱，巢蜜（长白山），甘草提取物，抽蜜机，生化反应釜，灌装机。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

分别用蜜酿（以下称A工艺）和蜜制（以下称B工艺）两种方法将两个浓度梯度的甘草提取物导入到成熟蜜中分别制成功能蜂蜜——蜜甘草制剂（A系列和B系列），成熟蜜作为对照组C组。分别进行物理性状评分、营养成分测定、卫生指标、生物活性成分以及抗氧化指标等测定。比较蜜酿和蜜制两种工艺的优劣。

1.2.2 生产工艺筛选

A工艺：利用蜜蜂采食含有甘草提取物的蜜蜂饲料以后酿制出功能蜂蜜，得到A0、A1和A2三种功能蜂蜜。

B工艺：通过生物反应釜把甘草制剂导入到成熟蜂蜜中制成功能蜂蜜制品，得到B0、B1和B2三种功能蜂蜜。

另外选取产自长白山的巢蜜作为对照组，编号为C。

1.3 指标测定

所有的样品分别送武汉市华测检测技术有限公司和华中农业大学食品科技学院进行测定。

1.3.1 测定指标

（1）活性成分：黄酮、酚酸和甲基乙二醛(丙酮醛)。

（2）抗氧化指标：SOD、MDA、GSH-PX和NO。

1.3.2 测定方法

功能蜂蜜产品的感官指标检测方法参照蜂蜜最新行业标准GH/T18796-2012。

总酚采用福林酚比色法；黄酮采用硝酸铝比色法；总蛋白测定采用考马斯亮蓝法；SOD采用WST法；MDA采用TBA法；NO酶采用一步法；GSH-PX参照南京建成试剂盒的操作说明书；羟甲基糠醛和甲基乙二醛采用液相分析方法。所有的数据用SPSS(18.0版）进行单因子分析。

2 结果

2.1 不同工艺对蜜甘草微生物指标的影响

对不同工艺生产的蜜甘草微生物指标（以菌落总数、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为代表）进行了检测。结果见表1。分组 菌落总数（CFU/g）大肠杆菌（CFU/g）金色葡萄球菌（CFU/g）

表1试验各组蜜甘草中代表性微生物含量Table 4.The effect of different Technological process on the Microbial indicators

2.2 不同工艺对蜜甘草活性物质的影响

对不同试验组的蜜甘草进行生物活性指标测定，分别用总黄酮、酚酸和甲基乙二醛(丙酮醛)作为蜜甘草的活性成分指标，结果见表2。从表2可以看出，B工艺生产的蜜甘草中总黄酮的含量显著高于A工艺和对照组C，且具有统计学差异。

表2试验各组蜜甘草的总黄酮、总酚酸和甲基乙二醛(丙酮醛)的比较Table2.The content of Bioactive substances of Bee-Licorice in Different Group

2.3 不同工艺对蜜甘草的抗氧化指标的影响

分别测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和一氧化氮酶（NO）以及氧化产物丙二醛（MDA）的含量。结果见表3。

表3.试验各组蜜甘草中SOD、GSH-PX和NO以及MDA含量的比较Table 3.Comparition of the Antioxidant Index in Different Group

3 分析

3.1 不同工艺对蜜甘草微生物指标的影响

从表1看出，A工艺生产的蜜甘草总菌落含量低于B工艺，且有统计学差异（p≤0.05）。但是对人体有害的金色葡萄球菌和大肠杆菌都未检出。

蜂蜜的农药残留和微生物安全性指标中规定[1]，铅(P b)含量不大于1 mg/kg，四环素族抗生素残留量不大于0.05 mg/kg，羟甲基糠醛不大于4 0 mg/kg，酸度不大于40 mL/kg。菌落总数不大于1 000CFU/g，大肠菌群不大于0.3 CFU/g，嗜渗酵母计数不大于200 CFU/g，霉菌不大于200 CFU/g，特殊要求的致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)不得检出[2]。

由于时间和经费的原因，只检测了菌落总数以及大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量。生产的各种蜂蜜的菌落总数远远低于国标的最下限，而且大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均检出。说明本试验的A工艺和B工艺均达卫生标准。

3.2 不同工艺对蜜甘草活性物质的影响

对不同试验组的蜜甘草进行了生物活性指标测定。分别用总黄酮、酚酸和甲基乙二醛(丙酮醛)作为蜜甘草的活性成分指标，结果见表2。从表2可以看出，A工艺生产的蜜甘草中总黄酮的含量显著高于A工艺和对照组C，且有统计学差异。

蜂蜜中的总黄酮类化合物包括黄酮、黄酮醇和黄烷酮等。其中，较常见的有：黄芩素、芹菜素和槲皮素等黄酮类；橙皮素和乔松素等二氢黄酮类；染料木素等异黄酮类；白杨素、桑色素、山奈酚和高良姜素等黄酮醇类；柚皮素、短叶松素和儿茶素等黄烷类。蜂蜜中黄酮的含量因受到蜜源植物、地理因素、气候特征等条件的影响差异很大[3]，因此黄酮的种类及含量成为检测蜂蜜质量和区分蜂蜜差异的重要因素之一[4]。

蜂蜜中的总酚酸——酚类物质是蜂蜜中重要的生物活性成分，其生物活性主要表现为清除自由基，可以清除超氧阴离子自由基、过氧亚硝酸盐自由基、脂质过氧化自由基、DPPH自由基、ABTS+、羟自由基等[5-6]。因而具有抗氧化性，能预防和治疗多种疾病，引起国内外众多学者的广泛关注。同时酚类物质抗氧化性还表现在抑制氧化剂的氧化能力，即具有还原能力，还原能力的大小可以说明酚类物质的抗氧化能力强弱，因此认为酚酸也有可能成为新的鉴别蜂蜜花源和质量的指标。从结果可以看出，A工艺生产的蜜甘草中总酚酸含量显著高于工艺B和对照组C，且有统计学差异。

总而言之，总黄酮和总酚酸的含量是评判蜂蜜品质好坏的一个重要标准。它们都是酚类物质，起作用的活性基团是其化学结构上存在一个或者多个羟基。由结果可知，尽管总黄酮和总酚酸的含量各有差异，对于总酮和总酚酸的含量，蜜制组（B系列）略高于蜜酿组（A系列）。可能是由于气候的原因，加上科研时间比较紧，蜜酿时间不够长，所产生的蜜酿型蜜甘草没有达到成熟蜜的标准。

本研究中，蜜酿组（A系列）中丙酮醛（MGO）含量为0.2～0.3 mg/g，而蜜制组（B系列）和对照组尚未检出。这个现象说明，MGO成分存在于刚刚蜜酿好的蜂蜜中，经过长时间存放或者经过加工后的成熟蜂蜜中，该活性物质不稳定或者被破坏。

3.3 不同工艺对蜜甘草抗氧化指标的影响

蜂产品中抗氧化的功能因子主要是黄酮类化合物、酚类化合物、维生素类和酶类等，这类物质能够协同作用从而起到清除自由基的作用。实验证明，蜂产品具有清除自由基的作用[7-8]，其中黄酮类化合物对DPPH自由基、邻苯三酚自氧化产生的自由基清除率最高。

本研究中，蜜酿工艺组的蜜甘草只有A2组的SOD活性显著高于蜜制组和对照组C，其它各组SOD含量有差别，但没有统计学意义。对于丙二醛MDA指标，蜜制组（A2和A3）和对照组C与蜜酿组（B1、B2和B3）之间有显著差异，蜜酿组蜂蜜新鲜，样品抗氧化能力强，能抑制环境中脂质过氧化反应。

虽然生产工艺对蜂蜜中抗氧化酶以及脂质过氧化产物的含量影响不大，但是蜂蜜能使机体抗氧化物酶的活性显著提升。蜂蜜具有抗氧化作用的报道很多，赵华等[9]研究表明，蜂蜜对吸烟造成的肺损害有保护作用。ZakiahJubri等[10报道麦卢卡蜂蜜具有抗氧化作用，对机体具有保护作用]。TuranYaman等[11]报道，蜂蜜能抑制自由基和脂质过氧化，保护膜脂质不受氧化损伤的作用。

研究发现，加工工艺对GSH-PX和NO这两个抗氧化酶影响不大。因此，本试验的研究进一步表明：蜜制和蜜酿这两种工艺生产的蜂蜜的抗氧化能力有一定的影响，特别是MDA产物含量影响比较大。但对GSH-PX和NO这两个抗氧化酶影响不大。

4 小结

研究表明，只要蜂蜜生产者从源头起的各个环节做好保品质的工作，严格把关生产中每个细节，优化生产工艺，做好蜂产品的深加工是可行的。用本项目选取的蜜制工艺生产的功能性蜂产品——蜜甘草可以与蜜酿蜜甘草媲美，可以用科学的蜜制方法替代蜂蜜的蜜酿手段。