miR-21与胃癌的关系

苏利佳，苏华华，王艳华，赵金映

三峡大学医学院 形态学系，湖北 宜昌 443002

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，具有较强的侵袭性和转移性，临床确诊时多数病情已进入晚期，预后极差[1]。寻找有益于胃癌早期确诊的新途径，将极大地改善胃癌患者的预后。其中，microRNA（miRNA）分子的结构及其在肿瘤进程中的功能引起了学者们广泛关注。这些由19～25个核苷酸组成的小分子可通过与靶基因3′非翻译区的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译而调控肿瘤细胞信号转导，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、运动和侵袭中发挥重要作用[2-3]。

在这些miRNA分子中，miR-21参与胃癌的病理进程。miR-21定位于染色体17q23.2，紧邻空泡膜蛋白 1（vacuole membrane protein 1，VMP1）基因，在核糖核酸内切酶RNaseⅢ作用下，miR-21的前体pre-miR-21被剪切成前导链miRNA-21-5p和后随链miRNA-21-3p[4]。miR-21分子在胃癌组织和胃癌细胞系中呈高表达状态，它能与多种靶基因，如富含AT的特异性序列结合蛋白1（special AT-rich sequence-binding protein-1，SATB1）、程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）、人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）、凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，APAF1）、金属蛋白酶抑制因子3（metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3）和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）相互作用，进而激活肿瘤增殖信号，促进肿瘤血管生成和肿瘤迁移[5]。此外，miR-21还可作为胃癌诊断标志物，用于评估胃癌的临床分期、分级及预后[6]。在此，我们就miR-21分子作为胃癌标志物、与胃癌增殖转移的关系，以及miR-21分子抑制剂研究进展做简要总结，通过梳理miR-21与胃癌间的相互关系，为胃癌研究相关学者提供参考。

1 miR-21可作为胃癌标志物

先前研究已发现miRNA在结构上高度保守，稳定地存在于各种体液中，可以作为疾病的生物标志物[7]。并且miRNA广泛存在于人体组织及体液中，各种疾病的不同状态下miRNA的表达情况也不同，因此临床医生或科研人员可以通过检测体液中的miRNA水平来诊断疾病和评估预后。Xu等[8]发现胃癌组织中miR-21-3p和miR-21-5p的表达均高于癌旁组织，在肿瘤浸润深度、淋巴结转移阶段，miR-21-3p和miR-21-5p均为高表达水平。miR-21-3p和miR-21-5p可作为胃癌诊断的潜在生物标志物，但在判断胃癌Ⅱ或Ⅲ期TNM分期中，miR-21-5p在区分肿瘤分化程度方面更有优势。

胃癌患者外周血中miR-21相对水平也显著高于健康人群，可作为胃癌血清学筛查的分子标志物[9]。miR-21与各临床病理特征均无相关性，但miR-21的高表达可影响胃癌的发生和患者的生存时间。如有学者选取胃癌患者50例，采集患者外周血标本，并以50例健康人作为对照，对比研究miR-21和miR-182基因在胃癌患者外周血和胃癌组织中的表达差异，结果发现胃癌患者外周血中miR-21和miR-182的相对表达水平明显高于正常健康人，且miR-21和miR-182的高表达预示着患者的生存时间缩短。

miR-21表达水平与胃癌预后关系密切。Sierzega等[10]发现，miR-130a、miR-331、miR-19a、miR-223、miR-106a、miR-21和miR-374在原发性肿瘤中过表达。而Obermannova等[11]发现胃癌组织中miR-10b、miR-21、miR-93和miR-107的表达水平明显高于非肿瘤组织，miR-10b、miR-21、miR-145表达升高与胃癌患者预后不良显著相关。Emami等[12]采用Real time PCR检测了30例胃癌患者和30例健康对照者血浆中miR-21和miR-222的表达水平，发现胃癌患者血浆中miR21和miR222的表达水平明显高于对照组，因而他们认为外周血循环中miR-21和miR-222水平可以作为胃癌诊断标志物。

miR-21还可作为胃癌腹膜转移的诊断标志物。临床研究发现，超过一半以上的胃癌晚期患者在根治性切除术后发生腹膜转移，是晚期胃癌患者死亡的首要原因之一[13]。Soeda等[14]研究了外泌体包裹的miRNA（ex-miRNA）在接受根治性手术的胃癌患者中作为微创生物标记物的有效性，发现miR-21与PDCD4的mRNA表达水平呈负相关，并且miR-92a与前列腺素E受体4的mRNA表达水平呈负相关。研究提示胃癌腹膜复发者与无腹膜复发者的ex-miR-21和ex-miR-92a水平有明显差异，因此ex-miR-21和ex-miR-92a可能成为预测Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者腹膜复发和预后的有效的微创生物标志物。

miR-21参与PD-1/PD-L1通路介导的胃癌术后Th17/Treg细胞失衡。Zheng等[15]发现胃癌切除术后的患者Th17细胞减少，Treg细胞增多，PD-1/PD-L1表达增加；并且RORt和IL-17表达降低，而Foxp3和TGF-1表达升高。在体外实验中，通过Ad-sh-PD1沉默PD-1可以促进miR-21的表达，增加Th17细胞百分比，降低Treg细胞百分比。因此，miR-21的过表达增加了Th17细胞百分比，降低了Treg细胞百分比。这表明miR-21参与PD-1/PD-L1通路介导的胃癌术后Th17/Treg细胞失衡，如能有效监测胃癌切除术后患者miR-21表达水平，维持Th17/Treg细胞平衡，可有效改善患者预后。然而，当前的研究仍存在实验结果统计分析方法标准不统一，样本量较小的问题。如果合理应用检测手段监测其体内水平，即可将miR-21作为良好的胃癌诊断指标。

2 miR-21参与胃癌病理进程

研究发现，miR-21可负调控Smad7基因，促进胃癌细胞增殖和转移[16]。而Smad7是Smad家族成员，属于TGF-β超家族配体，参与细胞信号转导，发挥抑癌因子的作用。Smad7可以通过阻止Smad2/Smad4复合物的形成来阻断TGF-β信号的形成。Jiang等[17]研究表明Smad7在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达水平降低，而敲除miR-21-5p基因后，Smad7基因表达上调，且SGC-7901细胞的增殖能力显著下降。另一项有关胃癌腹膜转移的研究也发现，外泌体miR-21-5p可以靶向下调Smad7的表达，从而诱导HMRSV5细胞的间皮-间充质转化（mesothelial-to-mesenchymal transition，MMT），促进胃癌的腹膜转移[18]。Xiao等[19]研究发现，用miR-21模拟物转染MGC-803细胞后，miR-21的表达上调可促进上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进展。然而，转染miRNA-21抑制剂后E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达增多，胃癌细胞的EMT受到抑制。因此推测，在胃癌中miR-21的过表达可以通过沉默Smad7促进TGF-β途径，从而启动MMT，也可通过EMT影响胃癌细胞的迁移能力。

miR-21-5p促进胃癌的能量代谢[20]。Liu等[21]研究发现miR-21-5p在胃癌组织中显著上调，PDHA1在胃癌中的表达明显下调，两者表达程度为负相关。转染miR-21-5p模拟物的胃癌细胞乳酸产生增加，而转染其抑制剂的细胞乳酸产生减少，以上结果提示miR-21在胃癌中可能通过促进糖酵解，使胃癌细胞乳酸增加，具有促癌作用。进一步研究两者的关系发现，miR-21-5p能促进空白对照细胞的糖酵解，但不能促进PDHA1过表达细胞的糖酵解。而在抑制PDHA1表达的细胞中，miR-21-5p未能进一步增加糖酵解水平，说明miR-21-5p可以通过靶向调控PDHA1进而调节糖酵解，并且PDHA1的下调会促进胃癌糖酵解和从而影响胃癌的增殖分化。因此，通过调控miR-21-5p/PDHA1轴可以影响胃癌的糖酵解和进展过程是可行的。

miR-21参与激活胃癌增殖转移信号转导。Zhou等[22]发现沉默miR-21显著抑制了胃癌细胞的迁移和运动，这可能与波形蛋白的表达下调有关。研究还发现miR-21的下调促进了细胞凋亡，使细胞周期停滞于G0/G1期。进一步的研究表明，miR-21的下调使PTEN蛋白表达增加，但PTEN mRNA的表达无明显变化，进而降低了胃癌细胞中Akt的磷酸化。因此，miR-21可以通过调控PTEN/Akt信号通路来影响人胃癌细胞的增殖、运动和凋亡，有望成为治疗胃癌的靶点。

综上所述，miR-21可通过下调Smad7、PTEN、PDHA1信号，激活EMT进程，促进胃癌恶性发展。

3 抑制miR-21的相关研究

干扰或抑制miR-21信号的途径有miRNA抑制剂，病毒介导的pre-miRNA、sh-pre-miRNA，干细胞分泌的外泌体，以及人工包装miRNA的外泌体[23]。miRNA抑制剂在治疗肿瘤疾病中具有以下优势：首先，miRNA易穿过细胞膜；其次，由于缺少polyA尾，miRNA不具有免疫原性，不引发机体的免疫反应；第三，这些分子在体外和体内都相当稳定，可以通过对它们的进一步修饰以延长其生物半衰期。因此，有效开发miR-21抑制剂成为当前研究的热点。除了通过抑制miR-21表达激活PTEN/PI3K/mTOR信号轴外[24]，抑制miR-21分子功能的途径还有以下3种方式。

3.1 受体蛋白相关抑制作用

FZD6（frizzled6）是卷曲基因家族的一员，是非典型的Wnt信号蛋白的受体。越来越多的证据表明，FZD6参与了肿瘤的发生发展，是肿瘤细胞体外增殖和迁移的重要调控因子[25]。Yan等[26]发现FZD6的过表达可以靶向抑制miR-21的促癌作用，与典型和非典型Wnt途径中miR-21依赖的效应相关。另外发现，FZD6在胃癌组织和胃癌细胞系SGC7901、AGS中的表达较正常胃组织和正常胃上皮细胞系GES-1下调。而集落形成实验显示，促进FZD6表达可显著抑制肿瘤生长，Transwell实验还发现FZD6的表达上调可显著抑制胃癌细胞的迁移能力。而转染si-FZD6的胃癌细胞与转染si-Control的细胞相比，表现出更强的细胞增殖和迁移能力。FZD6通过激活非典型的Wnt途径来抑制胃癌细胞的增殖和迁移。因此，FZD6具有靶向miR-21来抑制胃癌细胞增殖和迁移的作用。

3.2 环状RNA相关抑制作用

circHIAT1是一种重要的具有潜在抗肿瘤功能的环状RNA（circRNA），已被证明在肾癌中具有肿瘤抑制作用。Quan等[27]发现circHIAT1可以抑制miR-21在胃癌中的促癌作用，胃癌组织中circHIAT1的表达明显低于癌旁组织。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）作为一种有丝分裂原活化的蛋白激酶通路，与胃癌细胞的生长和分化有关。PLCDH-circHIAT1转染MKN28和MKN45细胞后，细胞存活率下降，p53、p21表达水平升高，细胞凋亡。PI3K/AKT是经典的生存信号转导途径，调节着许多生物学过程，如增殖和凋亡。AKT通路在胃癌中经常被激活以促进胃癌细胞的生长，而PTEN通过抑制PI3K负向调节AKT通路。circHIAT1可以通过使miR-21表达下调来抑制胃癌细胞的增殖和EMT，并且抑制PTEN/PI3K/AKT和ERK信号通路发挥抗肿瘤作用。

3.3 lncRNA相关抑制作用

研究发现，在miRNA上长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与mRNA有着共同结合位点，lncRNA可通过结合相应的结合位点吸附miRNA，作为内源竞争RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与miRNA竞争性结合，消除miRNA的下游效应[28]。Li等[29]发现lncRNA生长特异抑制物5（growth arrest-specific 5，Gas5）在胃癌组织和细胞中低表达，miR-21在胃癌组织和细胞中高表达。与正常胃黏膜上皮细胞相比，胃癌细胞MKN45、MKN7和SGC-7901中Gas5的表达明显下调，miR-21的表达明显上调。双重萤光素酶报告显示miR-21降低了含有野生型3′非翻译区的Gas5的萤光素酶活性，但没有降低含有突变型3′非翻译区的Gas5的萤光素酶活性，这表明miR-21是MKN45细胞中Gas5的靶基因。Gas5的过表达和miR-21的抑制显著抑制了MKN45的增殖、迁移和侵袭，促进了胃癌细胞的凋亡，Gas5过表达和miR-21抑制显著降低Bcl-2蛋白表达，增加Bax和Caspase-3蛋白表达，进而降低了胃癌细胞的耐药性，促进了胃癌细胞的凋亡。Gas5转染胃癌细胞后，miR-21的表达明显降低，胃癌细胞的迁移受到明显抑制，体内实验结果与体外实验结果一致。因此，过表达Gas5靶向抑制miR-21表达，显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤，促进胃癌细胞凋亡。

母体表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是一种lncRNA，也是一种抑癌因子，在多种肿瘤组织中表达下调。Xu等[30]通过qRTPCR检测发现胃癌组织和细胞系中MEG3表达下调，miR-21表达上调，miR-21的表达受MEG3的负调控。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一类功能相关的含锌酶家族，能降解细胞外基质促进细胞侵袭。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管生成中起重要作用，促进内皮细胞增殖、迁移和侵袭。研究发现，转染lncRNA-MEG3的胃癌细胞与对照组相比细胞间接触更为紧密。MEG3的过表达降低了MMP-3、MMP-9和VEGF的表达，抑制胃癌细胞的EMT。MEG3过表达还使上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的表达上调，间质细胞标志物N-钙黏蛋白、Snail蛋白和β-连环蛋白的表达下调来抑制EMT，使胃癌细胞迁移能力下降，而miR-21的过表达通过激活EMT促进AGS的细胞迁移。共转染lncRNA-MEG3和miR-21模拟物可拮抗MEG3对细胞迁移的抑制作用。因此，MEG3/miR-21轴通过抑制胃癌EMT而影响胃癌细胞的迁移能力。

有关抑制miR-21表达的上游调控分子总结于表1，然而当前研究尚存在一些问题：如实验中仅仅只关注了单个或几个miRNA水平的变化，并未反映整体水平的变化规律；又如一些miR-21抑制剂靶向特异性不高或存在脱靶问题，从而造成不良后果。但无论如何，研究针对miR-21的新药物，发现抑制miR-21的新靶点或新途径，未来应用于胃癌预防和治疗的前景广阔。

表1 抑制miR-21表达的上游调控分子

4 结语

miR-21分子与胃癌关系密切，它可通过多种途径促进肿瘤的进展。miR-21可作为胃癌早期诊断和预测术后复发的重要指标。通过抑制miR-21分子功能而抑制胃癌进展的研究取得了一定成果，但存在病例样本数过少、体内模拟实验缺乏等问题，使miR-21分子在胃癌病理进程中的作用机制探讨稍显不足，尤其是各个调控通路的相关性和级联性还未被完全发掘。相信随着医学技术的进步和机制研究的深入，miR-21分子及其抑制剂应用于胃癌早期诊断和治疗的春天即将到来。