细胞短期冻存液的优化研究

王雨琪，郑幽，蒋晓祎，孙强，江红

1.北京交通大学 理学院生命科学与生物工程研究院，北京 100044；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

细胞培养和保种技术广泛用于生命科学研究的各个领域，如疫苗研制、人工器官和再生医学等。冷冻保存是目前细胞长期保存的通用方法，有利于降低细胞被微生物污染和细胞之间交叉污染的风险，并且能够减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变，避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。然而，细胞的冻存和复苏过程会对细胞造成较大损伤，降低细胞膜中的脂质含量，产生过氧化，同时影响细胞的结构和代谢途径[1-3]。因此，冻存液作为细胞在低温状态下的保护介质，其作用尤为重要。

自Polge等发现细胞冻存液中添加甘油可提升细胞复苏后的存活数量，越来越多的实验致力于研究细胞的低温保护。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）就是细胞低温保护介质中的一种，DMSO可以有效降低细胞内的水分子含量，从而降低结晶形成的概率，减少细胞损伤[4-5]。目前应用最广的细胞冻存液是DMSO与胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的混合溶液，然而FBS价格昂贵，不适宜大量冻存使用。

本研究旨在探讨细胞短期冻存液的优化配方。我们以多种贴壁细胞及悬浮细胞为研究对象，观察分析不同血清含量的冻存液对细胞复苏状态和生长速度可能存在的影响，为细胞培养和留种等操作提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

贴壁细胞系人乳腺癌上皮细胞株MCF-7和人鼻咽上皮细胞株NP-69，悬浮细胞系人急性白血病淋巴细胞株CCRF、人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat和人慢性髓原白血病细胞K-562细胞株均由本课题组保存；DMEM培养基、1640培养基、胰蛋白酶和青链霉素混合液购自Macgene公司；胎牛血清购自康源公司；DMSO购自北京伊诺凯科技有限公司；台盼蓝购自Procell公司。

1.2 冻存液配制

按不同配比（体积分数）配制细胞冻存液［A组：10%DMSO+10%FBS+80%DMEM/1640培养基；B组：10%DMSO+20%FBS+70%DMEM/1640培养基；C组：10%DMSO+50%FBS+40%DMEM/1640培养基；D组：10%DMSO+90%FBS］，吹打混匀后于4℃保存。

1.3 贴壁细胞冻存

取正常连续培养且状态良好的贴壁细胞，弃去上清，用PBS冲洗2～3次，加入胰蛋白酶于37℃消化完全后取出，用含10%FBS及1%青链霉素混合液的DMEM混合培养基中和胰蛋白酶，将中和后的混合液分为4组并以1000 r/min离心收集细胞，分别用不同配比的冻存液重悬，放入程序降温盒中（平均降温速率-1℃/min），-80℃冻存。

1.4 悬浮细胞冻存

1000 r/min低速离心收集正常连续培养且状态良好的悬浮细胞，弃上清后用PBS重悬，分为4等份后再次离心收集细胞，分别用不同配比的冻存液重悬，放入程序降温盒中，-80℃冻存。

1.5 细胞复苏及培养

-80℃冻存4 d后，取出程序降温盒中的冻存管迅速放到预热至37℃的水浴锅中，融化完全后分别离心，弃去冻存液，分别以适量含10%FBS及1%青链霉素的DMEM和1640混合培养基重悬细胞，用血球计数板进行细胞计数。根据细胞正常状态下不同的生长速度，分别取NP-69、Jurkat和K-562细胞5×104个，MCF-7和CCRF细胞1×105个接种于12孔板，每组细胞设3个复孔，于37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.6 细胞形态观察

用倒置荧光显微镜在20×镜下分别拍摄复苏后24、30、48、72、96 h时细胞的生长状态，对比贴壁细胞的贴壁情况及悬浮细胞的成团情况，以及视野中细胞碎片和杂质的数量。

1.7 细胞增殖速率分析

细胞复苏培养24 h后，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，以DMEM混合培养基中和，1000 r/min离心3 min，弃上清，制备单细胞悬液。悬浮细胞连同培养基吸出后1000 r/min离心3 min，同样弃去上清制备单细胞悬液。取9 μL细胞悬液加入1 μL 0.4%台盼蓝溶液至终浓度0.04%，染色3 min后用血球计数板计数，记录活细胞数目。以上述同种方法在复苏培养后48、72、96 h分别重复1次台盼蓝染色计数，绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 不同配方的冻存液对贴壁细胞短期冻存后生长形态的影响

细胞复苏24 h后，D组MCF-7细胞贴壁能力稍差，A、B组复苏后贴壁能力较好。30 h后，A组细胞贴壁效果明显优于其他3组，48 h后4组细胞基本全部贴壁，视野中无明显细胞死亡，截至96 h，4组细胞复苏后的形态及大小无明显差异（图1A）。类似地，NP-69细胞复苏后，A组贴壁效果较好于其他3组，且在D组观测到少量细胞碎片，96 h内4组细胞复苏后的形态及大小也无明显差异（图1B）。提示，对于贴壁细胞的短期冻存，冻存液中不同血清含量对细胞活力无显著影响，低浓度血清含量（10%）即可维持短期冻存时贴壁细胞的生长活力。

图1 贴壁细胞在96 h内的生长状态

2.2 不同配方的冻存液对贴壁细胞短期冻存后增殖能力的影响

根据0、24、48、72和96 h记录的细胞数目绘制生长曲线，结果如图2，MCF7和NP-69细胞在用不同配方的冻存液短期冻存后，细胞生长速度无明显差异，提示，对贴壁细胞的短期冻存，冻存液中血清含量的变化对细胞增殖无显著影响，低浓度的血清含量（10%）即可维持短期冻存时贴壁细胞的增殖能力。

图2 贴壁细胞在96 h内的生长速度

2.3 不同配方的冻存液对悬浮细胞短期冻存后生长形态的影响

复苏24 h后拍照观察，4组均有悬浮细胞聚集形成的细胞团，但随着血清浓度降低，复苏后细胞死亡增多，细胞状态变差，细胞碎片增多。单独的悬浮细胞形态圆润，无明显差异，而不同的悬浮细胞形成的细胞团差异较大。

低血清浓度（A、B组）冻存液中复苏的CCRF细胞易形成较大细胞团，随着细胞死亡增多，漂浮的细胞碎片增多，细胞团数量减少，高血清浓度（C、D组）冻存液中复苏的CCRF细胞则较少形成大细胞团（图3A）。相反，高血清浓度冻存的Jurkat细胞在复苏后较易形成细胞团，且成团细胞数量较高于低浓度组（图3B）。而K-562细胞中少见大细胞团，多为20个细胞以内的较小细胞团，且在高血清浓度冻存液中复苏的K-562细胞有较多小细胞团形成（图3C）。

图3 悬浮细胞在96 h内的生长状态

结果提示，对于悬浮细胞的短期冻存，冻存液中不同血清含量对细胞活力影响显著，高浓度血清含量对维持短期冻存时悬浮细胞的生长活力有着关键作用，FBS∶DMSO为9∶1的比例最优。

2.4 不同配方的冻存液对悬浮细胞短期冻存后增殖能力的影响

如图4所示，用90%血清冻存液冻存的CCRF细胞（D组）在复苏后96 h内，其生长速度和数量明显优于其他配方。在Jurkat和K-562细胞中，高血清浓度的冻存液（C、D组）效果也优于低血清浓度冻存液（A、B组）。复苏后48 h内，C组中Jurkat和K-562细胞生长速度最快，截至复苏后96 h，D组中Jurkat和K-562细胞增殖数量最多。

图4 悬浮细胞在96 h内的生长速度

结果提示，对悬浮细胞的短期冻存，冻存液中血清含量的变化对细胞增殖有显著影响，血清含量越高越利于维持悬浮细胞短期冻存时的增殖能力，FBS∶DMSO为9∶1的比例最优。

3 讨论

细胞培养是大量实验开展的基础，建立安全有效的冻存及复苏方法是细胞培养的前提和基础。为了减少胎牛血清的潜在风险，节约经费，同时保证理想的冻存与复苏效果，本研究配置了4种不同血清浓度的冻存液并进行对比实验。实验结果表明，对于贴壁细胞，冻存液中的血清含量对复苏后细胞形态及生长增殖无明显影响；而对于悬浮细胞，随着血清浓度降低，复苏后细胞生长增殖能力明显减弱。综上，对于贴壁细胞的短期冻存与复苏，出于节约和风险性考虑，推荐使用10%血清含量的冻存液；而对于悬浮细胞的短期冻存与培养，出于保证实验效果的考量，推荐使用90%血清含量的冻存液。

除血清外，不同保护剂种类和降温方式均有可能影响细胞冻存和复苏效果。相对于非渗透性冻存保护剂，DMSO作为目前应用最广泛的渗透性保护剂，能有效促进细胞内水的玻璃化，降低细胞内结晶造成的细胞损伤。然而，细胞冻存的降温过程水分子会产生极性运动，在冷冻过程中细胞需充足的时间失水以防止细胞内冰晶形成，同时也应避免降温时间过长造成的细胞严重脱水损伤，因此在细胞冻存降温过程中存在最佳降温速率。目前程序性降温液氮冻存法已得到广泛应用，本次实验应用程序降温盒，以-1℃/min的平均降温速率进行缓慢降温，此外也可以采用分阶段降温措施，将降温速率控制在-1～-1.5℃/min，从而减少细胞损伤[6-7]。

需要注意的是，本次实验旨在探究短期冻存中冻存液对细胞的影响，冻存时间较短，细胞的选择也较有针对性，因此不能完全用于推断和模拟长期冻存对不同细胞的影响和损伤。此外，有研究证明用10%、20%、40%和90%血清含量的冻存液在-80℃短期冻存的干细胞，可达到与-196℃液氮低温冻存相同的效果，同时更加简便快捷[8]，但是否适用于悬浮细胞仍不明确。

综上所述，我们分别探讨了不同配比的冻存液在短期冻存中对贴壁细胞和悬浮细胞的影响，含有90%血清的冻存液在短期冻存中能更好地保护悬浮细胞，而冻存液中的血清含量对于贴壁细胞影响不大。这一结果可为贴壁细胞和悬浮细胞的培养和留种等操作提供指导。