菌酶融合工艺制作高肽发酵豆粕的研究及高肽发酵豆粕在保育料中替代鱼粉的应用

2020-03-10王晓明唐香山舒剑成

湖南饲料 2020年1期

王晓明毛悦唐香山邓敦舒剑成罗杰李慧

（唐人神集团股份有限公司，湖南株洲 412000）

大豆及其加工副产品因具有较高营养价值而被广泛应用于食品和饲料工业。豆粕作为大豆主要副产品之一，是非常优秀的畜禽植物蛋白饲料原料，蛋白质占40～48%，脂肪占1～2%，碳水化合物占10～15%，并含有多种矿物质、维生素和必需氨基酸，在畜禽日粮中广泛使用。

但豆粕中也还有很多抗营养因子，比如蛋白酶抑制因子、不良寡糖、抗原蛋白等，严重限制了其在幼龄动物上的应用。从二十世纪初期开始，人们就对大豆中抗营养因子进行研究，随着科技的发展，应用发酵或体外酶解的方法消除豆粕中的抗营养因子，提高豆粕的消化率，从而替代或部分替代日益看涨的动物蛋白（鱼粉、血浆蛋白等）已经成为人们研究的热点。本文将利用体外酶解和发酵联合处理的方法，研究出一种制作高肽发酵豆粕的生产工艺，并研究此发酵豆粕在保育料中替代鱼粉的应用。

1 材料与方法

豆粕颜色浅黄色，烤大豆香味，呈不规则碎片状，不含过量杂质，粗蛋白46.08%（实测）。

碱性蛋白酶（2.4AU/g，诺维信）、风味蛋白酶（500LAPU/g，诺维信），中性蛋白酶(0.8AU/g，诺维信)、酸性蛋白酶(10 万U/g)、植物乳杆菌（实验室筛选菌株）。

试剂：氢氧化钠、丙烯酰胺、无水酒精、甘氨酸、Tris、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、甘油、β-疏基乙醇、溴酚兰、盐酸、正丙醇、正磷酸等。

仪器：电泳仪、电泳槽、高速离心机、微量进样器、移液枪、PH 计、硅胶板、层析缸、烘箱、喷雾干燥机。

1.4.1 实验室指标

（1）水分：参照GB/T 6435-2014 饲料中水分的测定；

（2）粗蛋白：参照GB/T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法；

（3）酸溶蛋白（小肽）：参照GB/T 22492-2008大豆肽粉；

（4）大豆抗原蛋白定性检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）；按照常规方法配置12%的分离胶和5%的浓缩胶。取酶解豆粕烘干样品1.0g，加入20.00ml 0.03mol/L 的Tris-Hcl（ph=8，包括0.01mol/L 的β-巯基乙醇）在室温下浸泡1 小时（每10 分钟搅拌一次），然后10000rpm 下离心20 分钟，取上清液40 微升，加入10 微升5×样品缓冲液（5×loading buffer 蓝色），沸水浴5 分钟，然后取10 微升点样，进行SDS-PAGE 电泳；

（5）发酵豆粕中不良寡糖定性检测：薄板层析法（TLC）；

利用不同大小的糖分子在硅胶板上的扩散速度的大小不同，将发酵豆粕中的寡糖分开。

①分别称取寡糖标样0.01g 溶于80%的乙醇溶液中，4℃保藏备用。

②准确称取发酵豆粕样品5.00g 于250ml 三角瓶中，加入50ml 80%的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。取2ml 浸提液，10000rpm 离心10min，4℃保藏备用。

③在预制硅胶板上点样，点样量为5 微升，点样干燥后在展开液中展开，展开至离硅胶板前沿2cm 处。自然晾干后，喷淋显色液，在140℃下烘5min 显色。

1.4.2 动物实验指标

平均日采食量、平均日增重、料肉比、腹泻率

2 结果与分析

本实验通过一系列单因素试验研究了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶对豆粕中抗原蛋白、酸溶蛋白及酶解液味道的影响，并在单因素的基础上做了复合酶试验及菌酶融合联合处理试验，最终确定高肽发酵豆粕制作工艺如下：

豆粕进行超微粉碎→加入自来水，料水比为1:10→灭菌处理（80℃处理30min）→加入20%的NaOH 溶液，把酶解液的初始PH 值调节为8.0→加入0.5%碱性蛋白酶、1%风味蛋白酶和0.1%中性蛋白酶（酶添加量以豆粕计），保温50℃酶解4h→加入5%植物乳杆菌菌液和0.1%酸性蛋白酶，37℃发酵48h→低温干燥→发酵豆粕T （高肽发酵豆粕）

2.2.1 抗原蛋白去除结果

大豆抗原蛋白指大豆蛋白中能够刺激机体产生抗体，并能与这些抗体结合，引起特异性免疫反应的物质。大豆种子蛋白中，大豆球蛋白约占40%，β-伴大豆球蛋白约占30%，α-伴大豆球蛋白约占15%，γ-伴大豆球蛋白约占3%，其中能引起仔猪过敏反应的主要是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。大豆球蛋白是一种沉淀系数为11S 的球蛋白，β-伴大豆球蛋白是7S 球蛋白，其中大豆球蛋白主要由酸性亚基A1、A2、A3、A4 和碱性亚基Basic 组成，β-伴大豆球蛋白主要由亚基α’、α 和β 组成。

由图1 知，使用新工艺生产的发酵豆粕T 中的抗原蛋白已经被全部去除掉，效果优于目前市售的发酵豆粕、酶解豆粕和膨化大豆。

2.2.2 新工艺生产的发酵豆粕中的酸溶蛋白含量和不良寡糖去除情况

表1 发酵豆粕T 中的酸溶蛋白含量

由表1 和图2 知，目前市售的发酵豆粕中的酸溶蛋白含量在8%左右，而使用菌酶联合处理生产的发酵豆粕T 中的酸溶蛋白含量可以达到36.5%，而且发酵豆粕T 中的水苏糖和棉子糖也被全部去除掉了。

由以上实验结果知，使用菌酶融合工艺生产的发酵豆粕T，其酸溶蛋白含量可以达到36.5%（是目前市售发酵豆粕的4 倍），而且其中的大豆抗原蛋白和不良寡糖也被全部去除。

选择8～9kg 保育猪150 头，按体重相近、性别一致原则随机分为2 个处理组，每个处理5 个重复，每个重复15 头猪。分别饲喂两种试验日粮：对照组（鱼粉组），实验组（使用发酵豆粕T 替代鱼粉）。试验期间，安排专人负责饲养，自然通风，自由采食饮水，保持栏舍清洁卫生。试验过程中发现试验猪生病，及时治疗，3 天内不能康复即淘汰，进行为期12 天试验。

由表3 知，对照组和实验组之间的平均日采食量、平均日增重、料肉比和腹泻率没有明显差异，而且实验组的平均日增重还略高于对照组，料肉比也降低了0.12。

试验结果表明，在保育料中可以使用4%的发酵豆粕T 替代3%的鱼粉，而不会降低仔猪的生长性能。