基于Fenton反应产生的羟自由基检测方法比较

赵淑锐，杨 源，郑美青，薛 冰

（首都医科大学 中心实验室，北京 100069）

自由基是含有未成对电子的原子基团，具有非常活泼的化学性质，易失去或得到电子而发生氧化还原反应。这类物质不但可以直接参与生物体的一些生理和病理过程，而且在体内的多种疾病发生发展过程中扮演着重要角色[1-2]。

芬顿（Fenton）反应是一种非常成熟的产生羟自由基的方法，由于其高效、廉价、选择性好等特点被广泛应用于研究。芬顿反应所需试剂包含 Fe2+和H2O2，其中Fe2+作为催化剂存在。其反应机制是H2O2和Fe2+反应生成强氧化能力的羟自由基和Fe3+，Fe3+又被H2O2还原回Fe2+，形成循环反应，直至H2O2耗尽，反应终止[3]。由于羟自由基存在寿命短、浓度低等问题，在检测方面存在一定的难度。目前研究中大多采用几种间接方式，如电子自旋共振法（ESR）、荧光法、分光光度法等。

本文采用芬顿反应体系中加入羟自由基清除剂—抗氧化剂维生素C 的方法，以观察羟基自由基效应是否减弱或消除[4]，考察电子自旋共振法（ESR）、荧光法、分光光度法3 种检测方法中维生素C 对芬顿反应产生羟自由基的清除作用。为体内、体外氧化反应中羟基自由基的测量提出了一个思路和参考方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

电子顺磁共振波谱仪（ESR）JEOL JES-FA300，RF-5000 荧光分光光度计（Shimadzu 公司，日本），UV-2450 紫外-可见分光光度计（Shimadzu 公司，日本）、分析天平（220 g/0.1 mg）、玻璃毛细管（0.9～ 1.1 mm）、封口胶、顺磁管、25 mL 容量瓶。

1.2 试剂

DMPO（5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-Oxide，5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）、维生素 C 购自美国Sigma-Aldrich 公司；水杨酸（分析纯）、苯甲酸（分析纯）、30%市售H2O2、FeCl3（分析纯）、FeSO4·7H2O（分析纯）均购自北京化学试剂公司。

2 实验方法

2.1 荧光分光光度法测定羟自由基

荧光分光光度法利用Fenton 体系产生·OH，与荧光很弱的苯甲酸反应，生成具有强荧光的二羟基苯甲酸[5]，加入清除剂清除·OH，使体系荧光强度降低，通过测定体系荧光强度的变化间接测定体系·OH 变化。

2.1.1 配制溶液

配制15 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4），准确称取61.0 mg 苯甲酸溶于20 mL 超纯水中，得到25 mmol/L 的苯甲酸水溶液，准确称取 5.6 mg FeSO4·7H2O 溶于10 mL 超纯水中，得到2 mmol/L 的FeSO4水溶液，市售浓度30% H2O2稀释20 倍得1.5%的H2O2溶液，准确称取维生素C 35.2 mg，加入1 mL超纯水得到浓度为200 mmol/L 的维生素水溶液，然后用超纯水稀释至10、30、50、70、90、110 mmol/L。

2.1.2 测定不同浓度维生素C 清除·OH 的能力

取7 支5 mL EP 管，每支加入pH7.4 磷酸盐缓冲溶液2.0 mL，25 mmol/L 苯甲酸水溶液0.5 mL，2 mmol/L 的FeSO4水溶液0.4 mL。其中一支EP 管作空白加超纯水0.1 mL，其余6 支分别加入10、30、50、70、90、110 mmol/L 的维生素C 水溶液0.1 mL；最后再分别加入1.5%H2O2水溶液0.1 mL。混匀，室温下反应45 min[6]，于λex300 nm、λem408 nm 波长处测定各管的荧光强度F，并计算不同样品对·OH 的清除率[7]。清除率I(%)的计算公式：I=(F0-Fx)/F0×100。式中：F0为空白对照样品荧光强度测量值；Fx为加入待测样品的荧光强度测量值。根据浓度与清除率的变化，计算出维生素C 清除羟自由基的IC50值。

2.2 紫外可见光分光光度法测定羟自由基

利用·OH 能选择性攻击水杨酸（SA）产生二羟基苯甲酸，由于酚羟基与Fe3+显色反应生成紫红色配合物，用紫外可见光分光光度计测定530 nm 处吸光值可反映体系中·OH 浓度，加入·OH 清除剂会使水杨酸-Fe2+-H2O2溶液吸光度降低[8]。

2.2.1 配制溶液

准确称取13.9 mg FeSO4·7H2O 溶于10 mL 超纯水中，得到5 mmol/L 的FeSO4水溶液，准确称取8.1 mg FeCl3溶于10 mL 超纯水中，得5 mmol/L 的FeCl3水溶液，市售浓度30% H2O2稀释300 倍得0.1%的H2O2溶液，准确称取13.8 mg 水杨酸，溶于10 mL 乙醇溶液中得5 mmol/L 的水杨酸乙醇溶液，将节2.1.1 中所得200 mmol/L 的维生素C 水溶液稀释40 倍，得到浓度为5 mmol/L 的维生素C 水溶液。

2.2.2 水杨酸与不同试剂的光谱扫描

取6 只25 mL 容量瓶，每只容量瓶中加入3 mL 5 mmol/L 的水杨酸乙醇溶液，6 只容量瓶分别加入FeSO4水溶液、FeCl3水溶液、0.1%H2O2溶液、5 mmol/L的维生素C 水溶液，1 mL 的5 mmol/L 的FeSO4水溶液和0.1%的H2O2溶液、超纯水各1 mL，最后加超纯水定容到25 mL 并摇匀，20 min 后对上述6 种溶液进行光谱扫描[9]，保存数据。

2.2.3 测定不同浓度维生素C 清除·OH 的能力

取8 只25 mL 容量瓶，每只加入3 mL 的5 mmol/L的水杨酸乙醇溶液和1 mL 5 mmol/L 的FeSO4水溶液；其中1 只作为未损伤组加超纯水定容至25 mL，1 只作为损伤组加1 mL 0.1%的H2O2溶液后加水定容至25 mL，其余6 只分别加入1、2、3、4、5、6 mL 的5 mmol/L 的维生素C 水溶液，然后每只加入1 mL 0.1%的H2O2溶液后定容到25 mL，摇匀。室温反应20 min，测定530 nm 波长处的吸光度A，根据所得数据计算不同组样品对·OH 的清除率[9-10]。清除率I(%)的计算公式：I=(Ae-Ax)/(Ae-A0)×100%。式中：A0为未损伤组吸光度的测量值，Ae为损伤组的吸光度测 量值，Ax为加入待测样品的吸光度测量值；根据浓度与清除率的变化，计算出维生素C 清除羟自由基的IC50值。

2.3 电子顺磁共振波谱法测定羟自由基

1945 年发展起来的电子顺磁共振技术，为自由基的检测开辟了新的途径。其原理是利用自旋捕捉剂与不稳定的自由基发生反应，产生另外一种稳定的，可以用电子自旋共振波谱法检测的新自由基（自旋加合物）。DMPO（5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-Oxide，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）作为自旋捕捉剂捕捉·OH，生成稳定形态的DMPO-OH，可进行ESR 分析，其特征图谱为1∶2∶2∶1[11]。其反应式为：Fe2++H2O2→ Fe3++OH－+·OH，DMPO+·OH → DMPO-OH。

2.3.1 配制溶液

准确称取13.9 mg 的FeSO4·7H2O 溶于5 mL 超纯水中，得到10 mmol/L 的FeSO4溶液；将市售浓度30% H2O2稀释30 倍，得浓度1%的H2O2溶液；准确称取250 mg 的DMPO，加入22 mL 水溶解得到浓度为100 mmol/L 的DMPO 水溶液。将节2.1.1 中得到200 mmol/L 的维生素 C 水溶液稀释 4 倍得到50 mmol/L 的维生素C 水溶液。用超纯水稀释至9.6、8.0、6.4、4.8、3.2、1.6 mmol/L。

2.3.2 测定不同浓度维生素C 清除·OH 的能力

测定对照样品以扣除试剂本身对自由基的影响，将10 mmol/L 的FeSO4·7H2O 溶液、超纯水、100 mmol/L的DMPO 水溶液，1%的H2O2溶液各取5 μL 按顺序加入EP 管中，涡旋混匀后利用虹吸原理吸入石英毛细管中，放入样品保护测试管，记录反应时间保持测试液在反应1.5 min 时进行测定。测样品时用样品溶液代替超纯水，其余操作同上。每个浓度平行测定3次，测量后取平均值。测试参数为Center filed:336mT,Sweep width:7.5×1,Sweep time:30.0s,Mod width:0.35 ×1,Amplitude:2.00 ×100,Power:1 mW；自由基清除率I(%)的计算公式：I=(h0-hx)/h0×100%；式中：h0为对照样品中ESR 谱信号强度测量值；hx为样品中ESR 谱信号强度测量值[12]。I值越大，表明样品清除自由基能力越强。根据浓度与清除率的变化，计算出维生素C 清除羟自由基的IC50值[12]。

3 结果及讨论

3.1 荧光分光光度法测定维生素C 清除羟自由基的结果

荧光分光光度法测定的实验结果表明（见表1），维生素C 与空白对照相比表现出明显的清除·OH 的活性。不同浓度维生素C 清除羟自由基曲线如图1 所示，随着维生素C 浓度的增加，其清除能力也逐渐增加。在3.55 mmol/L 浓度时，测到的信号荧光强度接近基线，显示了较强的清除能力，计算荧光分光光度法测定维生素 C 清除羟自由基半数清除率 IC50为0.965 7 mmol/L。

苯甲酸-Fenton 体系荧光分光光度法法利用Fenton 体系产生·OH，与荧光很弱的苯甲酸反应，生成具有强荧光的二羟基苯甲酸。该方法测量简单、方便、准确，但是影响荧光强度的因素较多，包括环境温度、酸度、溶剂、光照等。另外羟自由基寿命很短，在溶液中大约只能存在微秒级，且浓度很低，因此在室温下需要有足够反应时间，才能不断产生羟自由基与苯甲酸反应。该方法有文献报道45 min 后荧光强度达到最大并且最稳定[13]。由于溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度会随着温度的升高而降低，因此要注意实验过程中环境温度的影响。

表1 荧光法测定不同浓度维生素C 清除·OH 的荧光强度及清除率

图1 荧光分光光度法测定不同浓度 维生素C 清除·OH 曲线

3.2 紫外可见光分光光度法测定维生素C 清除羟自由基的结果

对水杨酸、水杨酸-Fe2+、水杨酸-Fe3+、水杨酸-H2O2、水杨酸-维生素C、水杨酸-Fe2+-H2O2溶液进行紫外可见光光谱扫描，发现其中水杨酸、水杨酸-Fe2+、水杨酸-H2O2、水杨酸-维生素C 的紫外可见光吸收光谱基本相同，但从图2 可以看出，水杨酸-Fe2+、水杨酸-Fe3+、水杨酸-Fe2+-H2O2的紫外吸收光谱存在一定差异，各组差异吸光度值见表2。水杨酸-Fe3+、水杨酸-Fe2+-H2O2溶液为紫红色，最大吸收波长为530 nm，二者吸收曲线相同；水杨酸-Fe2+在530 nm 波长处没有最大吸收，但加入H2O2后在530 nm 处则会产生明显吸收；水杨酸、水杨酸-H2O2、水杨酸-维生素C 在530 nm 波长处均未发现吸收。

紫外分光光度法实验结果表明：维生素C 表现出明显的清除·OH 的活性（见表3）。随着维生素C 浓度的增加，清除能力也逐渐增加。计算水杨酸-紫外分光光度法测定维生素C 清除羟自由基半数清除率IC50为0.810 8 mmol/L。

图2 紫外可见光分光光度计扫描的吸收曲线

表2 紫外可见光分光光度法测定各组 样品在530 nm 处的吸光度

表3 紫外可见光分光光度法测定不同组别 在530 nm 处的吸光度值及清除率

由实验结果可以看出，水杨酸-紫外可见光分光光度法测定羟自由基具有测量简单、便捷、准确等优点。但是，因为反应过程相对比较复杂，水杨酸与羟自由基反应可生成2,3-二羟基苯甲酸或2,5-二羟基苯甲酸，有很多的中间产物与支线产物。此外羟自由基的寿命很短，特别是浓度很低的时候，因此需要提供足够的反应时间，使不断产生的羟自由基与水杨酸反应，直到产生足够实验检测的二羟基苯甲酸。因此水杨酸-紫外分光光度法测定羟自由基所需要的时间相对较长。此外，由于此方法测量的基本原理是基于酚羟基与Fe3+显色反应生产的紫红色物质，一旦测试实验中存在还原性很强的物质，就会导致Fe3+被还原，从而影响实验结果的可靠性[14]。

3.3 电子顺磁共振波谱法测定维生素C 清除羟自由基的结果

电子顺磁共振波谱法实验结果（见表4）表明：与空白对照相比，维生素C 表现出明显的清除·OH 的活性，不同浓度维生素C 清除·OH 信号见图3。可以明显地看出随着维生素C 浓度的增加，羟自由基加合物的信号也明显减弱，表明其清除能力也逐渐增加。依据清除率计算电子顺磁共振波谱法测定维生素C 清除羟自由基半数清除率IC50为0.738 1 mmol/L。

表4 顺磁法测定维生素C 清除·OH 自由结果

图3 不同浓度维生素C 清除羟自由基的ESR 图谱

由电子顺磁共振波谱法实验结果可以看出，运用自由基捕集剂（DMPO-ESR）技术测定羟基自由基的简单快速有效，DMPO 作自由基捕获剂与羟基自由基产生的自旋加合物的ESR 谱表现出1∶2∶2∶1 的特征谱线，可以提供自由基结构的详细信息。该方法既可以用来定量检测也可以用作定性检测。但是它的仪器成本较高，还有一个因素就是大多自旋加合物都不能稳定存在，有的可能只能稳定存在几分钟或几十分钟[15]，因此在实验过程中应尽快进行测试，并精准控制测试的时间，以保证实验的平行性。目前的研究领域主要在医疗、病理和药理实验等研究方面[16]。

4 结语

通过采用3 种不同的检测方法检测Fenton 反应产生的羟自由基，发现3 种测定方法均能够准确地检测羟自由基存在。其中荧光法、紫外可见光分光光度法测定羟自由基其中涉及多步反应属于间接法检测羟自由基，方法简便、易操作，不涉及大型贵重仪器，适用于定量检测中低浓度的羟自由基的研究。由于这2种方法均涉及反应时间问题，所以所需要的检测时间相对较长。自旋捕捉-电子自旋共振技术能够直接捕捉住目标羟基自由基，简单易行。电子自旋共振法与荧光法、紫外分光光度法方法相比，具有灵敏度高、反应快速等优点，而且该方法可以提供自由基结构的详细信息，也可以用作定性检测。另外该方法对样品的状态基本没有要求（固态、液态、气态均可）。仪器比较昂贵，普遍性不高是该方法的主要缺点。相信随着自由基研究领域以及科技的不断发展，会有越来越多的先进且便捷廉价的检测羟自由基的方法来完善这一检测技术。