适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

王蔚芳, 向 玲, 王 琳, 黄 滨, 李会涛

适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

王蔚芳1, 向 玲2, 王 琳1, 黄 滨1, 李会涛3

(1. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071; 2. 中国海洋大学 水产学院, 山东 青岛 266003; 3. 山东百福生物科技有限公司, 山东 济宁 273200)

本实验旨在探究维生素E对半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因表达的影响。作者在每千克等氮等能的基础饲料中分别添加0、400和1 600 mg的DL-α-生育酚乙酸酯 (维生素E)投喂半滑舌鳎()成鱼(464±2.6) g, 进行为期8周的养殖实验; 另外, 在L-15培养基中添加0、18和54 μmol/L的维生素E, 对半滑舌鳎成鱼(464±2.6) g的垂体细胞进行为期3 d的体外原代培养实验。分别取垂体组织和原代细胞, 通过荧光实时定量PCR分析其mRNA的相对表达量。实验结果表明: 垂体组织中mRNA的相对表达量随着饲料中维生素E含量的增加而呈现先升高后下降的变化趋势, 在400 mg/kg组时显著高于其他各组(<0.05); 随着细胞培养液中维生素E浓度的升高,mRNA的相对表达量显著增加(<0.05)。由此可见, 适宜浓度的维生素E能够促进半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因的表达。

半滑舌鳎(); 维生素E; 生长激素基因; 养殖; 垂体原代细胞

生长激素是一种由垂体前叶合成和分泌的多肽类激素, 能够不通过靶腺而刺激生长, 动员脂肪分解, 促进蛋白质的合成, 抑制葡萄糖的氧化, 提高对钾、钙、磷、硫等元素的利用[1]。相关研究表明生长激素能够促进鱼类的骨骼生长与肌肉蛋白质的合成[2]。

维生素E又名生育酚, 最初发现时被认为是维持动物正常生殖所必需的一种脂溶性物质[3]。维生素E在鱼类生长、免疫功能等方面的研究已逐渐成为热点[4, 5]。摄食维生素E含量为150 mg/kg饲料的点带石斑鱼(), 其增质量率显著提高[6]。用添加维生素E的配合饲料投喂鲻鱼()幼苗, 能够有效地促进其生长[7]。关于维生素E如何调控鱼类的生长, 是否与生长激素有关, 至今未见相关研究报道, 因此值得进一步探讨。尽管维生素E是重要的抗氧化剂[8, 9], 但它还被证明可作为基因的调节因子[10]。新近水生动物研究表明适宜浓度的维生素E能够促进大菱鲆促性腺激素基因的表达[11]。在陆生动物研究中指出, 饲料中添加15 IU/kg维生素E时, 蛋雏鸭血清生长激素含量显著高于对照组[12]; 此外, 青大麦叶提取物(已鉴定为α-生育酚琥珀酸酯)可以促进体外培养的大鼠垂体前叶细胞分泌GH[13]。因此作者假设维生素E通过基因调节的功能影响生长激素基因的表达。

半滑舌鳎()属鲽形目(Pleuronectiformes)、鳎亚目(Soleoidei)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(), 为中国的本地种, 主要分布在中国的黄渤海域[14]。其体型大、生长快、味道鲜美、高蛋白、营养丰富、经济价值高, 在中国的养殖规模也逐渐扩大[15]。半滑舌鳎与大菱鲆、牙鲆()同为中国最具发展潜力的工厂化养殖和土池养殖的海水品种[16]。目前已经开展了关于半滑舌鳎生长激素基因在大肠杆菌中原核表达的研究[17], 以及半滑舌鳎生长激素基因的多态性与生长激素及生长性状相关性的研究报道[2]; 此外, 在饲料中添加1 200 mg/kg的维生素E可以有效提升半滑舌鳎亲鱼的繁殖性能[18], 在饲料中添加1 084.58 mg/kg的维生素E饲喂半滑舌鳎幼鱼84 d, 经迟缓爱德华氏菌攻毒后, 能有效降低其红细胞的过氧化损伤[19]。而关于半滑舌鳎维生素E和生长激素关系的研究未见报道。因此, 参照半滑舌鳎垂体细胞体外原代培养方法[20],借助养殖和细胞培养实验, 探究不同含量的维生素E与垂体组织中(养殖实验)和垂体原代培养细胞中(细胞实验)mRNA相对表达量之间的关系, 初步讨论维生素E促生长的分子机制, 并为半滑舌鳎人工配合饲料的研制提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验用鱼

实验用120条体质量为(464±2.6)g健康的1龄半滑舌鳎雌性成鱼, 购自莱州明波水产有限公司(山东, 莱州), 为当年孵化和培育的同一批鱼。

1.2 饲料制备与养殖管理

养殖实验的饲料中维生素E添加量是参照肖登元等[18]在半滑舌鳎亲鱼饲料中的添加量(0、200和1 200 mg/kg)报道以及作者的预实验结果进行设置。本实验设3个组, 每组设3个重复, 每组饲料中维生素E的添加量分别是0、400和1 600 mg/kg。维生素E以DL-α-生育酚乙酸酯(Sigma)的形式按照计算比例逐级混匀到次粉中。在基础饲料中, 以鱼粉、酪蛋白为主要蛋白源, 以鱼油、豆油为主要脂肪源, 饲料配方及营养组成如表1。固体原料均过60目筛, 所有原料充分混合均匀后, 通过机械挤压形成颗粒饲料(4 mm), 并在60℃的烘箱中干燥至湿度为10%, 用密封塑料袋保存在–20℃的冰柜中以供使用[18]。

养殖实验在莱州明波水产有限公司养殖场进行。正式实验开始前对所有的鱼投喂7 d的基础饲料(表1), 以适应实验条件。在测量鱼体长和称重后随机分成九组到9个15 m3的圆形聚乙烯养殖桶中(直径: 150 cm, 高度: 60 cm)进行流水养殖实验, 每个桶里放养半滑舌鳎10尾, 养殖用水为过滤海水, 流速是50 L/min。每3个养殖桶随机分成一组投喂相同的饲料, 每天早晚2次投喂, 投喂率为鱼体质量的2%, 进行为期8周的养殖实验。实验期间水温范围为24℃~27℃; 盐度30~31, pH为7.8~8.1。溶解氧含量大于5.65 mg/L。每天早上清除粪便和多余的饲料以保持良好的水质条件。

表1 实验基础饲料配方组成及营养组成

注:1维生素混合物(mg/kg或g/kg 饲料): 硫胺素, 25 mg; 核黄素, 45 mg; 盐酸吡哆醇, 20mg; 维生素B12, 0.1 mg; 维生素K3, 10 mg; 肌醇, 800 mg; 泛酸, 60 mg; 烟酸, 200 mg; 叶酸, 20 mg; 生物素, 1.20 mg; 维生素A, 32 mg; 维生素D, 5 mg; 维生素E, 0mg; 次粉, 13.67 g;2矿物质混合物(mg/kg或g/kg 饲料): 硫酸镁, 1200 mg; 硫酸铜, 10 mg; 硫酸锌, 50 mg; 硫酸铁, 80 mg; 硫酸锰, 45 mg; 氟化钠, 2 mg; 氯化钴(1%), 50 mg; 硒代硫酸钠(1%), 20 mg; 碘酸钙(1%), 60 mg; 沸石, 13.485 g

1.3 垂体原代细胞培养

1.3.1 细胞培养基配制

先取4.76 g Hepes和9.6 g L-15培养基, 充分混溶于水, 4 h后用NaOH将pH调至7.4, 抽滤(除菌), 分装, 即制成L-15基础培养基。在L-15基础培养中加入胎牛血清(终体积为5%)、青霉素(终浓度为100 U/mL)、链霉素(终质量浓度为100 μg/mL), 即制成完全培养基, 4℃下保存。所有操作在细胞培养室进行, 有专用橱柜和冰箱放置物品, 所有解剖工具、器皿等经高压消毒后使用, 实验过程中用的水、磷酸缓冲液(PBS)等为无菌型商品。

1.3.2 细胞分离

在细胞培养室的准备室内, 用75%酒精浸泡鱼头后, 无菌条件下取20条成鱼垂体组织, 移入超净工作台内后更换培养液和培养皿, 保证无菌操作。随后垂体组织剪成1 mm3小块, 用PBS冲洗, 加入0.25%的胰蛋白酶, 用量约为组织块的10倍, 放入18℃水浴锅中45 min。水浴后用2 mL PBS吹打组织块, 倒入200目/70μm的尼龙网过滤, 取滤液以100/min的速度离心10 min, 除去上清液, 并重悬沉淀, 分装至六孔板, 1 mL/孔, 置于24℃培养箱中进行培养。

1.3.3 细胞培养

细胞培养液中维生素E浓度是参照大菱鲆的相关研究[11], 细胞实验分3组, 每组3个重复, 维生素E的添加量分别为0、18和54 μmol/L。将维生素E预先溶解在无水乙醇中, 然后加入到L-15完全培养基中(无水乙醇的终浓度为0.1%,), 置于24℃培养箱中培养3 d[20]。

1.4 RNA的提取与cDNA文库的构建

养殖实验结束后, 分别在每个养殖桶随机取3尾鱼, 无菌取出垂体组织; 细胞实验结束后, 将每孔垂体细胞转移至15 mL离心管中, 以100 g/min的速度离心 10 min之后取细胞沉淀。加入1 mL TRIzol (Invitrogen, USA), 按照程序提取总RNA, 使用Nanodrop2000定量并调整至相同浓度备用, 并取适量RNA进行琼脂糖凝胶电泳, 检测RNA完整度, 取质量较好的RNA作为cDNA文库构建的模板。

以总RNA模板构建cDNA文库, 选用Prime­Script RT regent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara, Japan)进行反转录实验, 操作流程参照该使用说明书进行, 制成的cDNA文库保存于–20℃冰柜中。

1.5 定量PCR分析

在GeneBank中获得半滑舌鳎生长激素基因序列(HQ334196), 通过Primer Premier 5软件进行引物设计, 由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成, 引物浓度为10 µmol/L。应用实时荧光定量PCR(qPCR)分析不同水平维生素E条件处理下生长激素基因的表达情况。以20×cDNA稀释液为模板, 进行荧光定量PCR扩增, 参照TB GreenII(Tli RNaseH Plus)(Code No. RR820A)试剂盒说明, 扩增体系为20 μL(包括10 μL TB GreenII (Tli RNaseH Plus), 0.8 μL PCR Forward Primer, 0.8 μL PCR Reverse, 1 μL cDNA模板, 7.4 μL RNase-free dH2O)。为减小实验误差, 每个样品均设置3个重复, 18S核糖体RNA基因作为内参引物[21], 与目的基因在相同条件下进行扩增, 引物序列见表2。反应按95℃ 10 min, 95℃ 10 s, 58.4℃ 15 s, 72℃ 20 s, 再依次按照95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s绘制溶解曲线。实验中PCR产物通过溶解曲线确定扩增准确性及特异性, 使用2–∆∆Ct法计算mRNA相对表达水平[22]。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.6 数据统计分析

研究中所有实验均设置3个平行处理, 所得数据均以平均值±标准误差表示, 并通过SPSS 19软件进行one-way ANOVA分析及基于LSD最小显著差异法的多重比较。当值<0.05时, 认为具有显著差异。

2 结果

从图1中可知, 摄食维生素E含量为400 mg/kg饲料的实验组的鱼的表达水平显著高于其他各组(<0.05); 当维生E添加量为1 600 mg/kg时,表达量为1.91%, 显著高于对照组的1.13%(<0.05)。在细胞实验中, 随着维生E浓度的升高,mRNA表达量显著上升(<0.05), 当维生E浓度为54 μmol/L时,mRNA表达量最大(图2)。

图1 饲料中维生素E含量对半滑舌鳎垂体组织中生长激素mRNA表达的影响

图2 维生素E浓度对半滑舌鳎垂体原代细胞中生长激素mRNA表达的影响

3 讨论

鱼类生长激素是由鱼类脑垂体前叶合成分泌的由191个氨基酸组成的单链多肽, 为非糖蛋白激素, 且具有明显的种族特异性[23]。其作为信号分子与遍布组织的生长激素受体结合, 启动细胞内的信号转导机制, 活化一系列信号蛋白, 调节基因的表达。生长激素对机体的主要代谢功能表现为促进体组织的生长及细胞体积和数量的增加[24]。研究表明饲料中添加维生素E对罗非鱼()[25]、鲤鱼()[26]、云纹石斑鱼()[27]的生长有明显的促进作用。维生素E的促生长作用是否与生长激素有关？目前关于维生素E调控生长激素水平的研究报道有限且集中在陆生动物中, 但其体内、体外研究结果相似, 即维生素E可以提高生长激素水平[12, 13, 28]。在本养殖实验中, 饲料中添加维生素E显著上调半滑舌鳎mRNA的表达量(<0.05), 这提示维生素E有可能参与并促进了mRNA的表达。为了规避体内众多因素的干扰, 作者开展了体外细胞培养实验, 进一步验证维生素E和mRNA的表达的相关性。在体外垂体原代细胞培养中,mRNA表达量随着细胞培养液中维生E浓度的升高而显著增加(<0.05), 证实了维生素E确实参与并促进了mRNA的表达, 也进一步为养殖实验的结论提供了依据。

虽然维生素E参与了mRNA的表达, 但本实验数据显示维生素E的应用剂量会影响mRNA的表达水平。在饲料中添加400 mg/kg维生素E时,mRNA表达量最高, 而进一步添加至1 600 mg/kg时其表达量显著降低(<0.05), 这也与实验鱼的生长数据吻合, 即1 600 mg/kg时半滑舌鳎的增质量率显著低于400 mg/kg组(<0.05), 且对应的半滑舌鳎的死亡率显著高于400 mg/kg组(<0.05)(数据待发表)。这说明mRNA表达量受维生素E剂量的影响。相关研究也指出, 维生素E缺乏或者过量都会影响鱼的生长[29]。然而本研究体外细胞实验结果没有出现下调现象, 这可能与维生素E的浓度设置有关, 因为其浓度梯度的设置是参考相关实验设计而没有进一步增加其梯度, 在今后开展相关研究实验时有必要考虑这一点。目前, 几乎未见关于维生素E和mRNA表达的相关报道, 其相互关系和作用机制值得进一步探讨和研究。

关于维生素E调控基因表达的机制尚未十分明确。相关研究指出,mRNA的合成依靠Ca2+胞吐作用方式, 且环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化在mRNA合成表达的信号通路中起着关键的作用[30]。Ca2+浓度的上调会抑制CREB磷酸化过程, 从而可能影响mRNA的转录过程[31]。据此分析, 维生素E作为抗氧化剂能与氧化型低密度脂蛋白进行有效拮抗刺激Ca2+的摄入作用, 从而抑制细胞内钙离子浓度的升高[32], 引起下游信号调控基因的表达。另外一种可能则是维生素E通过与生育酚转运蛋白或者ATP结合转运蛋白结合的方式直接转运到垂体细胞内, 作为基因调节因子, 从而影响mRNA合成表达。也可能是维生素E通过改变相关代谢酶的活性(蛋白激酶C、磷酸酯酶A2等)[33, 34]引起下游信号蛋白CREB磷酸化从而调节mRNA的表达。本实验结果表明了维生素E对mRNA表达的促进作用, 且为证明维生素E作为基因调节因子提供了依据。

4 结论

本研究表明维生素E能够上调mRNA的表达, 但应用剂量要适宜。在本实验条件下, 饲料中添加400 mg/kg维生素E时,mRNA表达量最高, 而进一步添加至1 600 mg/kg时会抑制其表达。

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An appropriate concentration of vitamin E promotes gene expression of growth hormone in

WANG Wei-fang1, XIANG Ling2, WANG Lin1, HUANG Bin1, LI Hui-tao3

(1.Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology of Qingdao, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2.College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3.Shandong Baifu Biotech Co., Ltd., Jining 273200, China)

This study aimed to investigate the effect of vitamin E on expression of the growth hormone genein pituitary tissues of half-smooth tongue sole (). DL-alpha-tocopherol acetate was added to the basic diet (vitamin E) at concentrations of 0, 400, and 1600 mg/kg diet to feed (464 ± 2.6) g semi-smooth tongue sole for 8 weeks. In addition, 0, 18, and 54 μmol/L vitamin E were added to L-15 medium for primary pituitary cell culture for 3 d. The expression ofin pituitary tissues and primary pituitary cells was analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that in theexperiment,mRNA expression significantly (0.05) increased when dietary vitamin E increased from 0 to 400 mg/kg and then significantly decreased in the group that

1600 mg/kg (0.05). In theexperiment, the expression level ofincreased significantly with increasing vitamin E concentration (0.05). Therefore, the proper concentration of vitamin E could promote the expression ofin the pituitary tissue of half-smooth tongue sole.

; vitamin E; growth hormone gene; aquaculture; primary pituitary cell

Aug. 2, 2019

[National Natural Science Foundation of China, No. 31872578, No.31502177]

S968.9

A

1000-3096(2020)02-0113-07

10.11759/hykx20190802001

2019-08-02;

2019-10-14

国家自然科学基金面上项目(31872578); 国家自然科学基金青年项目(31502177)

王蔚芳(1980-), 女, 吉林通化人, 副研究员, 主要从事水产动物营养相关研究, E-mail: wangwf@ysfri.ac.cn; 李会涛,通信作者, E-mail: yulees@163.com

(本文编辑: 谭雪静)