Tat结合蛋白30在胃癌肿瘤组织中的表达及其与患者预后的关系研究

刘庆伟，李勇，檀碧波，范立侨，赵群，李兆星，杨沛刚

胃癌是全球第二大常见恶性肿瘤，具有侵袭性强、预后差的特点。目前研究发现，胃癌的侵袭性与抑癌基因的突变密切相关[1]。Tat结合蛋白30（TIP30）是一种新发现的抑癌基因，通过抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、修复损伤DNA、调节肿瘤细胞葡萄糖耐量、抑制核转运等途径参与肿瘤细胞的发生发展[2-4]。TIP30在多种肿瘤组织中处于缺失或低表达状态，并且其低表达与肿瘤患者的预后密切相关[5-6]。基质金属蛋白酶9（MMP-9）可通过分解基底膜胶原蛋白促进肿瘤细胞侵袭转移。目前国内外关于TIP30与胃癌相关性的研究鲜有报道，本研究旨通过检验TIP30、MMP-9在肿瘤组织中的表达水平及其相关性，探讨TIP30与胃癌临床病理特征、肿瘤侵袭间的关系，及其对患者预后的影响。

本研究价值：

（1）胃癌的侵袭性与多种抑癌基因的突变及其异常有关，Tat结合蛋白30（TIP30）是新近发现的一种肿瘤抑制因子，其具有多种功能，包括致瘤抑制、凋亡诱导和降低血管生成特性，但其是否改变胃癌患者预后以及与肿瘤侵袭转移的关系尚未得到研究证实。

（2）刘庆伟等研究结果初步表明TIP30是胃癌患者的一个重要预后因子，且TIP30可能是一种潜在的抑制胃癌侵袭转移的新靶点，为今后的体外实验及体内试验的开展提供了方向。

1 资料与方法

1.1 研究标准 纳入标准：（1）有完整的临床病历资料，并经病理诊断确诊；（2）均行根治性胃切除术联合D2淋巴结清扫术，术前未接受过放化疗治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）术中探查有远处转移；（3）姑息性手术切除原发病灶；（4）残胃癌患者。

1.2 一般资料 收集2012年5月—2013年2月在河北医科大学第四医院行手术治疗的106例胃癌患者的肿瘤组织石蜡标本，患者中男82例，女24例；平均年龄56（27，76）岁；肿瘤直径：＜5 cm 45例，≥5 cm 61例；浸润深度：T1～T239例，T3～T467例；分化程度：中/高分化65例，低分化41例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期70例；有淋巴结转移43例。

另选取2017年就诊于河北医科大学第四医院行胃镜活检的30例胃溃疡患者，取其正常胃黏膜组织标本进行研究。纳入标准：诊断为浅表胃炎、十二指肠炎者。排除标准：患者胃黏膜组织病理检查结果为胃黏膜重度不典型增生。

上述标本采集均征得患者本人同意，本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会审核通过。

1.3 采用免疫组化法检测肿瘤组织和正常胃黏膜组织TIP30、MMP-9表达情况 石蜡切片脱蜡、乙醇脱水；加3% H2O237 ℃下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次×3 min；行抗原修复，山羊血清孵育，加TIP30抗体（1∶200）、MMP-9抗体（1∶200），4 ℃下孵育过夜；PBS冲洗3次×5 min；加生物素标记，37 ℃下孵育20 min；PBS冲洗3次×5 min；加辣根过氧化物酶标记，37 ℃下孵育30 min；PBS冲洗3次×5 min；加新配制的DAB显色液，阳性显色为棕黄色；自来水冲洗，苏木素复染，乙醇脱水、透明，封固。PBS替代一抗作为阴性对照。

结果判定：由2位高年资经验丰富的病理医师指导收集病理标本和阅片，TIP30、MMP-9的阳性表达均定位于胞质，结果按半定量积分法判断，根据阳性细胞所占比例及染色强度进行评分。不着色为0分，基本不着色（淡黄色）为1分，中等着色（棕黄色）为2分，强着色（棕褐色）为3分。着色细胞面积按阳性细胞占总细胞数的百分比判断：阳性细胞占总细胞数的百分比≤5%为0分，6%～24%为1分，25%～49%为2分，≥50%为3分。两项评分相加，0～1分为（-），2分为（+），3～4 分为（++），5～6分为（+++）；（+）～（+++）均表示阳性。

1.4 随访情况 随访截至2018-02-28。共随访3～60个月，中位随访时间35个月，采取电话、门诊复查方式随访，复发转移的患者均经影像学检查及病理学检查证实。生存期的计算从手术日期到由复发转移而死亡的日期为止，或到随访截止日期。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。偏态分布计量资料以M（P25，P75）表示；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析；采用Kaplan-Meier法绘制胃癌患者的生存曲线，通过Log-rank检验比较生存曲线的差异性；采用Cox比例风险回归模型分析患者的预后因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIP30在肿瘤组织及正常胃黏膜组织中的表达情况 TIP30在肿瘤组织中的阳性表达率为41.5%（44/106），低于正常胃黏膜组织的86.7%（26/30），差异有统计学意义（χ2=19.089，P＜0.001，见图1）。

2.2 不同临床特征患者肿瘤组织TIP30表达情况比较 不同性别、年龄、肿瘤直径、分化程度患者肿瘤组织中TIP30表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期患者肿瘤组织中TIP30表达情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.3 MMP-9在肿瘤组织及正常胃黏膜组织中的表达情况 MMP-9在肿瘤组织中的阳性表达率为82.1%（87/106），高于正常胃黏膜组织的23.3%（7/30），差异有统计学意义（χ2=37.800，P＜0.001，见图2）。

2.4 不同临床特征患者肿瘤组织中MMP-9表达情况比较 不同性别、年龄、肿瘤直径、分化程度患者肿瘤组织中MMP-9表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期患者肿瘤组织中MMP-9表达情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.5 肿瘤组织中TIP30、MMP-9表达情况的相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，肿瘤组织中TIP30、MMP-9表达呈负相关（rs=-0.405，P＜0.001）。

2.6 不同TIP30表达情况的胃癌患者生存情况比较TIP30阳性表达的胃癌患者中位生存时间为45个月，TIP30阴性表达的胃癌患者中位生存时间为23个月；不同TIP30表达情况的胃癌患者生存曲线比较，差异有统计学意义（χ2=9.025，P=0.003，见图3）。

图1 TIP30在肿瘤组织及正常胃黏膜组织中的表达情况（免疫组化染色，×400）Figure 1 Expression of TIP30 protein in gastric cancer tissue and normal gastric mucosal tissues

表1 不同临床特征患者肿瘤组织TIP30表达情况比较〔n（%）〕Table 1 Expression of TIP30 protein in gastric cancer patients by different clinical features

图2 MMP-9在肿瘤组织及正常胃黏膜组织中的表达情况（免疫组化染色，×400）Figure 2 Expression of MMP-9 protein in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa tissues

表2 不同临床特征患者肿瘤组织中MMP-9表达情况比较〔n（%）〕Table 2 Expression of MMP-9 protein in gastric cancer patients by different clinical features

2.7 胃癌患者预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析 以患者预后情况（赋值：生存=0，死亡=1）为因变量，以性别（赋值：女=0，男=1）、年龄（赋值：＜60岁=0，≥60岁=1）、肿瘤直径（赋值：＜5 cm=0，≥5 cm=1）、分化程度（赋值：中/高分化=0，低分化=1）、淋巴结转移情况（赋值：有=1，无=0）、TNM分期（赋值：Ⅰ+Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）、TIP30表达情况（赋值：阳性=1，阴性=0）为自变量，进行Cox比例风险回归模型分析，结果显示，淋巴结转移情况〔HR=2.842，95%CI（1.597，5.057）〕、TIP30表达情况〔HR=0.517，95%CI（0.299，0.895）〕是胃癌患者预后的影响因素（P＜0.05，见表3）。

3 讨论

胃癌根治性手术是改善患者预后最有效的手段，但50%～60%接受根治性手术切除的患者如T3/T4期的患者，其术后转移及复发率高，5年生存率仅为30%左右[7]。然而临床上常有处于同一肿瘤分期的胃癌患者预后不同，因此有必要寻找影响其预后的因素，从而使胃癌治疗的疗效最大化。

图3 不同TIP30表达情况的胃癌患者生存曲线Figure 3 Survive curve of gastric cancer patients by the expression level of TIP30

表3 胃癌患者预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析Table 3 Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors for gastric cancer patients

TIP30是新发现的一种30 kD的Tat结合蛋白，TIP30基因又称CC3或HTATIP2，是1997年发现的一种与肿瘤转移抑制相关的基因[8]。TIP30基因具有促进肿瘤转移、凋亡及血管形成等作用，并且在多种肿瘤细胞中均出现表达异常。CHEN等[9]研究发现，喉鳞状细胞癌组织中TIP30表达水平显著低于癌旁正常组织（46.7%比79.0%），TIP30表达水平也与其肿瘤分期、分化、淋巴结转移情况密切向关。LIU等[10]研究发现，TIP30在胆囊腺癌中低表达，且与低分化、肿瘤肿块大小、淋巴结转移情况和腺癌浸润程度密切相关。黄奇迪等[11]通过免疫组化法研究发现，TIP30在乳腺癌组织中的表达情况与TNM分期、淋巴结转移情况、人表皮生长因子受体2（HER-2）和分子分型相关，其蛋白表达缺失可能导致肿瘤细胞的早期转移，是乳腺癌患者预后的影响因素。樊丽伟等[12]研究发现，TIP30在结直肠腺瘤与结直肠癌中的表达水平明显低于正常结直肠黏膜组织，TIP30表达水平随着腺瘤绒毛成分及恶变率的增加而逐渐降低。本研究免疫组化法结果显示，TIP30在肿瘤组织中的阳性表达率明显低于正常胃黏膜组织，同时发现肿瘤的浸润程度、淋巴结转移情况、TNM分期与肿瘤组织中TIP30表达情况有关。多项研究结果表明，TIP30与肿瘤转移密切相关，杨普等[13]研究结果显示肿瘤组织中TIP30低表达的程度与肿瘤细胞转移存在密切相关性，胶质瘤细胞的生长和体外侵袭能力可通过TIP30基因过表达被抑制[14]。通过抑制TIP30基因表达而增强EMT基因的表达从而促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力[15]。

基质金属蛋白酶家族（MMPs）可以进一步降解细胞外基质中各种蛋白成分，分解侵袭的组织学屏障，促进肿瘤侵袭和转移，其在胃癌侵袭转移及预后中起关键作用。而MMP-9为MMPs中重要的一员，通过分解基底膜胶原蛋白从而促进肿瘤细胞侵袭转移[16]。GUO等[17]研究发现，TIP30在胰腺癌组织中低表达，其表达降低与淋巴结转移情况密切相关；在抑制TIP30表达后发现SW1990细胞MMP-9的表达上调、SW1990细胞侵袭和转移能力增强。本研究结果显示，MMP-9在肿瘤组织中阳性表达率明显高于正常胃黏膜组织，不同浸润程度、淋巴结转移情况、TNM分期与肿瘤组织中MMP-9表达情况有关；分析TIP30、MMP-9在肿瘤组织中的相关性发现，二者存在明显的负相关性，提示TIP30可能通过调控MMP-9促进肿瘤的侵袭转移。生存分析结果显示，不同TIP30表达情况的胃癌患者生存曲线比较，差异有统计学意义；Cox比例风险回归模型分析结果显示，淋巴结转移情况、TIP30表达情况是胃癌患者预后的影响因素，表明TIP30表达阳性、无淋巴结转移情况的胃癌患者预后较好，生存期明显延长。

综上所述，TIP30在胃癌肿瘤组织中低表达，且与肿瘤的侵袭转移有关，同时是患者预后的影响因素。但本研究尚存在一定的不足之处，例如TNM分期是目前公认的重要的预后因素，其在本研究结果中并未得到阳性结果，可能与Ⅰ、Ⅱ期样本量少有关，有待于今后更进一步的研究证实。

作者贡献：刘庆伟进行文章的构思与设计，撰写论文；李勇进行研究的实施与可行性分析，对文章整体负责，监督管理；檀碧波、范立侨、赵群负责文章的质量控制及审校；李兆星、杨沛刚负责数据收集、整理，进行基础实验、统计分析。

本文无利益冲突。