枸杞中原花青素和总黄酮的抗氧化活性研究

黄婷，周璐，梅婵，徐慧

（江苏省理化测试中心，江苏南京 210042）

原花青素和黄酮是枸杞中最主要的两类活性成分，二者最显著的活性为抗氧化活性。目前常使用的抗氧化方法分为两类：一类为基于H原子转移的方法（HAT），包括ORAC法、TRAP法、脂质过氧化法等；另一类为基于电子转移的方法（SET），主要包括FRAP法、ABTS法、DPPH法等，这些方法多采用分光光度计测定颜色的变化，使用简单快速[1]。本实验中评价原花青素和黄酮的抗氧化活性采用FRAP法及DPPH法，以研究枸杞中原花青素和黄酮的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞（特级黑枸杞，宁夏）；原花青素标准品（阿达玛斯贝塔（上海）化学试剂有限公司）；芦丁（总黄酮）标准品（阿达玛斯贝塔（上海）化学试剂有限公司）；TPTZ（阿达玛斯贝塔（上海）化学试剂有限公司）；DPPH（阿达玛斯贝塔（上海）化学试剂有限公司）；ABTS（阿达玛斯贝塔（上海）化学试剂有限公司）。

KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；A-1000S水流抽气机（上海爱朗仪器有限公司）；OSB-2100油浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；UV-2102PC分光光度计（龙尼柯（上海）仪器有限公司）；HH-1系列数显恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司）。

1.2 枸杞中生物活性物质含量的测定

1.2.1 原花青素含量测定

称取原花青素标准品10.00 mg，加入甲醇并用超声溶解，定容至 10 mL，分别吸取 0 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，制得含量为 0.0～150.0 μg/mL 的系列标准溶液。将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比配制成300 mL混合溶液，储存备用。将枸杞样品研成粉末，密封置于阴暗处储存。称取粉末样品0.50 g，用30 mL乙醇溶解，并用超声处理约20 min，用乙醇定容至50 mL，摇匀，必要时离心或放置澄清后取上清液。于10 mL具塞试管中分别加入6 mL正丁醇盐酸溶液、1 mL系列标准管溶液和样品溶液、2 mL硫酸铁铵溶液（用2 mol/L盐酸配成2%的溶液），混匀，同步做空白实验。将所有试管置于沸水中精确反应40 min 后，立即放在冰水中 15 min。在 546 nm 处，用甲醇调零，测定标准系列溶液和样品的吸光度。

1.2.2 总黄酮含量测定

称取总黄酮标准品20.00 mg，并用80%乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中。分别吸取上述溶液2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL、15.0 mL、17.5 mL、20.0 mL 于 25 mL 容量瓶，用 80% 乙醇准确定容至刻度，摇匀，制得20.0～160.0 μg/mL的系列标准溶液。吸取0.5 mL上述系列标准溶液，依次加入1.5 mL 95% 的乙醇溶液、0.1 mL 10% 的 AlCl3溶液、0.1 mL 1 mol/L 的乙酸钾溶液以及 2.8 mL 蒸馏水，混匀。将所有标准系列溶液于室温下静置30 min。在415 nm处，用蒸馏水调零，测定标准溶液的吸光度。根据测定结果绘制总黄酮吸光度曲线。称取0.50 g枸杞粉末样品于烧杯中，加入少量甲醇溶液并超声后定容至50 mL容量瓶中，摇匀过滤，用旋转蒸发器将上层清液于45 ℃旋转蒸发至干后，加入20 mL 80%乙醇溶液溶解。按照上述方法测定样品溶液吸光度。

1.3 生物活性物质的抗氧化性研究

1.3.1 FRAP法评价抗氧化活性

FRAP 工作液的制备：称取 5.1 g CH3COONa，加入20 mL乙酸溶解，并用蒸馏水准确定容至250 mL，得到300 mmol/L的CH3COONa缓冲溶液备用；称取0.270 5 g FeCl3·6H2O，用蒸馏水定容至 50 mL，得到20 mmol/L 的氯化铁溶液备用；称取 0.031 2 g TPTZ 用10 mL 40 mmol/L 的 HCl溶液溶解备用。将上述 3 种溶液按体积比10∶1∶1均匀混合，得到FRAP工作溶液。

抗氧化活性测定：吸取0.2 mL样品提取液、6 mL FRAP工作液、0.6 mL蒸馏水，混合摇匀后于37 ℃水浴20 min；在593 nm处，用无水乙醇调零，测吸光度，VE溶液作阳性对照[2]。

FeSO4标准曲线制作：用无水乙醇配制FeSO4溶液（浓度梯度为 200～6 000 μg/mL），按照上述方法测定标准系列溶液的吸光度，得到曲线方程。FRAP值换算：在FeSO4标准曲线中，以样品吸光度找到相对应的FeSO4溶液的浓度，当FeSO4溶液的浓度为1 000 μg/mL 时，FRAP 值为 1。

1.3.2 DPPH法评价抗氧化活性

DPPH 溶液的配制：称取 0.019 7 g DPPH，用无水乙醇溶解（必要时超声或加热处理帮助溶解）并定容至250 mL，得到浓度为2×10-4mol/L的DPPH溶液[3]。

抗氧化活性测定：分别吸取2 mL样品提取液和2 mLDPPH溶液、2 mL样品的无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇、2 mL无水乙醇和2 mLDPPH溶液于3只试管中，混合摇匀，在黑暗环境下放置30 min，在 517 nm波长处，用无水乙醇调零后，测其吸光度。VE溶液作阳性对照。

2 结果与分析

2.1 生物活性物质的含量

如图1所示，原花青素的标准曲线在10～150 μg/mL浓度范围内与吸光度有良好的线性关系，其回归方程为：y=0.004 6x+0.010 6，R2=0.999 4。100 g 枸 杞 样品中原花青素含量为4.26 g，实验的重现性较好。

图1 原花青素的标准曲线

总黄酮的标准曲线在20～160 μg/mL浓度范围内与吸光度有良好的线性关系，其回归方程为：y=0.006 4x-0.023 3，R2=0.999 1。100 g 枸杞样品中总黄酮含量为0.68 g，实验的重现性较好，实验结果见图2。

图2 总黄酮的标准曲线

2.2 原花青素抗氧化活性测定

2.2.1 FRAP法对枸杞样品中原花青素抗氧化活性测定结果

FRAP法测定原花青素抗氧化能力的结果如图3所示。由图可知，FRAP法测定抗氧化性时有剂量依赖关系，在测试的浓度范围内，FRAP值随着原花青素浓度增加而增大，即原花青素浓度越高，FRAP值越大，反应体系中被还原成Fe2+-TPTZ的含量越高，样品浓度与FRAP值呈正相关关系。另外，在测试浓度范围内，样品的FRAP值远高于阳性对照VE。因此，样品有很强的Fe3+还原能力。

图3 原花青素的Fe3+还原能力

2.2.2 DPPH法对样品中原花青素抗氧化活性测定结果

DPPH法测定原花青素抗氧化能力的结果如图4所示。随着样品量的逐渐增加，原花青素浓度增加，在测试浓度范围内，原花青素对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，当添加量在6～10 μg/mL浓度范围内时，清除率的增加趋势变缓，当浓度达到一定水平，清除率将不在增加，而趋于平稳。另外，在测试浓度范围内，样品的清除率远高于阳性对照VE。因此，样品有很强的DPPH自由基消除活性。

图4 原花青素的DPPH自由基清除率

2.3 总黄酮抗氧化活性测定

2.3.1 FRAP法对样品中黄酮抗氧化活性评价结果

FRAP法测定总黄酮抗氧化能力的结果如图5所示。由图可知，在测试的浓度范围内，FRAP值随着总黄酮浓度增加而增大，呈正相关关系。当总黄酮浓度达到一定程度后，FRAP值增加缓慢。另外，样品的FRAP值远高于阳性对照VE。因此，样品有很强的Fe3+还原能力。

图5 黄酮的Fe3+还原能力

2.3.2 DPPH法对样品中黄酮抗氧化活性评价结果

DPPH法测定黄酮抗氧化能力的结果如图6所示。由图知，随着样品量的逐渐增加，黄酮浓度增加，黄酮含量与DPPH自由基的清除能力之间呈正相关关系，当添加浓度达到16 μg/mL之后，清除率的增加趋势变缓，清除率已经接近100%。另外，在测试浓度范围内，样品的自由基清除率高于阳性对照VE，而且清除率增加趋势随着阳性对照VE浓度升高而变缓。因此，样品有很强的DPPH自由基消除活性。

3 结论

本实验对枸杞中原花青素和总黄酮的含量进行了测定，同时采用了DPPH法和FRAP法对原花青素和黄酮的抗氧化活性进行评价。实验表明，原花青素和黄酮的抗氧化性均高于阳性对照VE。随着黄酮和原花青素浓度的增高，FRAP值和DPPH自由基的清除率增大，并且逐渐接近100%，可见总黄酮和原花青素的抗氧化性在这两种方法评价中，存在剂量依赖关系。对比原花青素和总黄酮的抗氧化能力，可发现原花青素对DPPH自由基的清除能力以及Fe3+的还原能力均高于黄酮。

图6 黄酮的DPPH自由基清除率