硒对铬-牛血清白蛋白互作光谱特征的影响

刘 康，胡承孝，蔡苗苗，高 林，张梦娇，巴 蕾，杨丹丹，王 旭，赵小虎，，*

(1.华中农业大学 资源与环境学院，微量元素研究中心，新型肥料湖北省工程实验室，湖北 武汉 430070； 2.农业农村部农产品质量安全检测与评价重点实验室，广东 广州 510640)

重金属铬(Cr)污染是一个全球性问题。有关Cr污染事件的报道层出不穷，各个国家都在不同程度上受其影响[1]。环境中的Cr主要以三价(Ⅲ)和六价(Ⅵ)形态存在，不同形态铬离子的活性/毒性水平差异显著[2-3]。其中，Cr(Ⅲ)为人体必需元素，而Cr(Ⅵ)毒性相对较大，有明显的致癌、致畸和致突变作用，对人体危害极大[4-5]。

环境重金属污染物进入体内后会与人体内的蛋白质结合，占据结合位点，产生毒性作用，从而使其变性或者丧失功能[6]。研究重金属对蛋白质的毒性效应是环境污染与健康领域的热点问题。有关重金属与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的研究结果表明，铅在一定程度上降低了BSA结构的稳定性[7]；铜离子对BSA荧光有明显的静态猝灭效应，且随着铜离子浓度增加，猝灭效果愈加明显[8]；镉对BSA有猝灭作用，既有静态猝灭又有动态猝灭，但静态猝灭占主导地位[9-10]。不同形态的铬均可与BSA结合，但是具体机理尚不明确，需要联合多手段进行更深一步的研究[6]。

硒(Se)是人体必需的微量元素之一，具有抗癌、增强人体免疫力和抗氧化的作用[11]。同时，它还具有拮抗重金属的作用[12]。研究表明，Se对重金属毒害有一定的缓解作用[13]。环境中适量的Se能够降低重金属对植物的毒性效应[14-18]。现已证实：Se是蛋白的活性中心，可通过抑制膜蛋白对重金属的转运、形成金属-Se-蛋白质复合体等途径减轻重金属的毒性效应。由此推测：Se可通过影响蛋白质的结构和功能进而缓解重金属对人体的毒害作用[19]。

蛋白质的空间构象和光谱特征是评价污染物对蛋白质毒性效应的重要指标。然而，生理模拟实验的影响因素众多，如温度、溶液pH值、离子浓度、研究手段等都会对实验结果有很大的影响，不同批次实验的研究结果可比性弱[6-10]。因此，联合多种手段，在相同实验条件下，对Cr、Se与蛋白质的结合机理进行多层次、多水平的研究很有必要。在此基础上，有望进一步阐释Se对Cr-蛋白互作体系的影响。本研究以BSA为研究对象，模拟生理条件(pH值7.4)，选用紫外光谱和荧光光谱研究了不同温度(298、308、313 K)条件下，Cr(Ⅵ)/Se(Ⅳ)与BSA的互作机制，以及Se(Ⅳ)对Cr(Ⅵ)-BSA互作体系的影响，旨在从生物化学角度揭示Cr(Ⅵ)对蛋白的毒性效应、Se(Ⅳ)与蛋白的作用机理，并明确Se(Ⅳ)是否在分子水平上具有缓解Cr(Ⅵ)毒害的作用及其机理，可以为研究人员从多角度揭示Se(Ⅳ)缓解Cr(Ⅵ)对有机体毒害作用的机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 实验仪器

RF-5301PC型荧光分光光度计，日本岛津；S2-Standard Kit型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UV-3100PC扫描型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-800KDE台式高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ABY-1001-U优柯浦元素分析型超纯水机，上海纯浦实业有限公司。

1.1.2 实验试剂

三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base)、BSA、布洛芬(Ibuprofen)、保泰松(Phenylbutazone)，均为生化试剂；盐酸、氯化钠、重铬酸钾、亚硒酸钠、无水乙醇，均为分析纯。实验用水为超纯水。

(1)0.1 mol·L-1pH值7.40的Tris-HCl缓冲溶液(以0.1 mol·L-1的NaCl维持离子强度，以下简记为缓冲液)。称取6.052 0 g Tris-Base(Angus化学试剂公司，纯度99.9%)、5.844 4 g NaCl(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，加水至800 mL溶解，用稀盐酸调节pH至7.40，贮存备用。

(2)BSA溶液：称取0.165 0 g BSA(Biosharp生物科技公司，相对分子质量66 000)，用缓冲液溶解并定容至250 mL，即为1.0×10-5mol·L-1的BSA储备液，贮存于4 ℃冰箱，用时按需稀释。

(3)Cr(Ⅵ)溶液：称取105 ℃烘干2 h的K2Cr2O7(国药集团化学试剂有限公司)1.471 0 g，加水溶解并定容至100 mL，即为0.1 mol·L-1的Cr(Ⅵ)溶液，贮存备用。

(4)Se(Ⅳ)溶液：称取Na2SeO3(国药集团化学试剂有限公司)1.729 4 g，加水溶解并定容至100 mL，即为0.1 mol·L-1的Se(Ⅳ)溶液，贮存备用。

(5)布洛芬溶液：称取0.257 8 g布洛芬(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，用无水乙醇溶解后定容至50 mL，即为0.025 mol·L-1的布洛芬溶液，用时按需稀释。

(6)保泰松溶液：称取0.385 5 g保泰松(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，用无水乙醇溶解后定容至50 mL，即为0.025 mol·L-1保泰松溶液，用时按需稀释。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 紫外光谱实验

选取Tris-HCl作为缓冲体系，pH值设定为7.40以模拟人体生理环境。多次实验下，BSA的荧光强度在此缓冲体系和pH条件下均较稳定。

向25 mL容量瓶中加入25 mL 1.0×10-5mol·L-1BSA溶液，然后分别加入0、5、10、20、30、40、50 μL Cr(Ⅵ)溶液，制成浓度梯度依次为0、2×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的Cr(Ⅵ)-BSA体系。室温下恒温30 min。用1 cm石英比色皿，以相对应浓度的Cr(Ⅵ)缓冲溶液(用缓冲液配制，下同)作为参比溶液，在190～450 nm范围内进行全波长扫描。加入的最大金属离子溶液总体积为50 μL，远小于25 mL，实验中可认为体积不变；因此，在实验浓度下Cr(Ⅵ)离子与蛋白的浓度比为整数。Se(Ⅳ)-BSA作用的紫外光谱研究步骤同此。

1.2.2 荧光光谱实验

向25 mL容量瓶中加入25 mL经缓冲液稀释过的1.0×10-7mol·L-1BSA溶液，然后分别加入0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50 μL Cr(Ⅵ)溶液，制成浓度梯度依次为0、1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的Cr(Ⅵ)-BSA体系溶液。在不同温度(298、308、313 K)恒温30 min，固定激发波长为280 nm，在300～450 nm范围内扫描蛋白的荧光发射光谱，激发狭缝为10 nm，发射狭缝为5 nm，扫描速度为600 nm·min-1。在相同条件下进行3次重复实验。Se(Ⅳ)对BSA作用的荧光光谱研究步骤同此。

由于荧光强度受荧光内滤效应的影响(所谓内滤效应指的是在蛋白质激发和发射波长处具有光吸收，导致荧光测定的结果不可靠)，通常情况下采用式(1)[20]进行校正：

Fcor=Fabse(Aex+Aem)/2。

(1)

式(1)中：Fcor和Fabs分别为校正后和原始的荧光强度，Aex和Aem分别为蛋白质-配体在激发和发射波长处的吸光度。本研究计算所用的相对荧光强度均为校正后的相对荧光强度。

1.2.3 结合位点的确定

向25 mL容量瓶中加入25 mL经缓冲液稀释过的1.0×10-7mol·L-1BSA溶液，将BSA溶液分成2组，一组加入10 μL布洛芬溶液，另一组加入10 μL保泰松溶液，室温下反应10 min后，分别加入0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50 μL Cr(Ⅵ)溶液，制成Cr(Ⅵ)浓度梯度依次为0、1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的分别含1.0×10-5mol·L-1布洛芬或保泰松的Cr(Ⅵ)-BSA-布洛芬或Cr(Ⅵ)-BSA-保泰松体系溶液，室温下反应30 min，固定激发波长为280 nm，在300～450 nm扫描蛋白的荧光发射光谱，激发狭缝为10 nm，发射狭缝为5 nm，扫描速度为600 nm·min-1。

1.2.4 Se(Ⅳ)对BSA-Cr(Ⅵ)体系构象的影响分析

向25 mL容量瓶中加入25 mL经缓冲液稀释过的1.0×10-5mol·L-1BSA溶液，然后加入20 μL 0.1 mol·L-1Cr(Ⅵ)溶液，室温下反应10 min，继而加入0、20 μL 0.1 mol·L-1Se(Ⅳ)溶液，制成BSA、Cr(Ⅵ)-BSA、Se(Ⅳ)-Cr(Ⅵ)-BSA体系，室温下反应30 min，用1 cm石英比色皿，以相对应浓度的Cr(Ⅵ)或 Se(Ⅳ)缓冲溶液作为参比溶液，在190～450 nm进行全波长扫描。

1.2.5 Se(Ⅳ)对BSA-Cr(Ⅵ)体系荧光光谱的影响分析

向25 mL容量瓶中加入25 mL经缓冲液稀释过的1.0×10-7mol·L-1BSA溶液，将BSA溶液分成2组，分别加入0、20 μL 0.1 mol·L-1Cr(Ⅵ)溶液，室温下反应10 min，然后分别加入0、2.5、5.0、7.5、10、20、30、40、50 μL Se(Ⅳ)溶液，制成Se(Ⅳ)浓度梯度依次为0、1×10-5、2×10-5、3×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol·L-1的分别含0、8×10-5mol·L-1Cr(Ⅵ)的Cr(Ⅵ)-BSA-Se(Ⅳ)体系溶液，室温下反应30 min后，固定激发波长为280 nm，在300～450 nm扫描蛋白的荧光发射光谱，激发狭缝为10 nm，发射狭缝为5 nm，扫描速度为600 nm·min-1。

1.3 数据统计分析

实验数据采用Excel 2010和SPSS 23.0进行统计分析，并采用Sigma Plot 10.0作图。

BSA浓度为1.0×10-5 mol·L-1。图中1～7指示的Cr(Ⅵ)浓度分别为0、0.2×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-5 mol·L-1. Lines 1-7 indicated solutions with Cr(Ⅵ) concentrations of 0， 0.2×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.图1 Cr(Ⅵ)与BSA结合的紫外吸收光谱特征Fig.1 Characteristics of ultraviolet absorption spectrum of Cr(Ⅵ) in combination with BSA

2 结果与分析

2.1 Cr(Ⅵ)-BSA体系光谱特征

2.1.1 Cr(Ⅵ)-BSA结合的紫外光谱特征

如图1所示，BSA主要有2个特征吸收带，峰位置分别在220 nm和280 nm附近，分别是蛋白肽键和一些氨基酸残基的吸收峰[20]。其中，220 nm处的吸收峰强度远远大于280 nm处的吸收峰强度，随着Cr(Ⅵ)浓度升高，BSA在220 nm处的特征峰逐渐增强，表现为增色效应，且峰位红移，而280 nm处的吸收光谱未发生显著变化。紫外光谱的变化表明，Cr(Ⅵ)与BSA分子外部一些维持骨架结构的基团(如羟基、氨基、巯基)发生作用使骨架结构松散，链状结构展开，二者形成复合物。

2.1.2 Cr(Ⅵ)-BSA结合的荧光光谱特征

以280 nm的单色光为激发光，苯丙氨酸(Phe)一般情况下不被激发，此时BSA的内源荧光主要来自于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基，且以Trp起主要作用，Tyr次之。Cr(Ⅵ)与BSA分子间的相互作用能够导致激发态荧光团的荧光猝灭，包括分子重排、能量转移、基态络合物的生成，以及碰撞引起的猝灭[6]。

BSA浓度为1.0×10-7 mol·L-1。图中1～9指示的Cr(Ⅵ)浓度分别为0、0.1×10-4、0.2×10-4、0.3×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-7 mol·L-1. Lines 1-9 indicated solutions with Cr(Ⅵ) concentrations of 0， 0.1×10-4， 0.2×10-4， 0.3×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.图2 Cr(Ⅵ)与BSA结合的荧光吸收光谱特征Fig.2 Characteristics of fluorescence spectrum of Cr (VI) in combination with BSA

Cr(Ⅵ)-BSA结合的荧光光谱特征见图2。图2中曲线1为不加Cr(Ⅵ)时以280 nm激发BSA的荧光光谱图。实验结果显示：BSA最大荧光峰出现在345 nm附近；而相同条件下，Cr(Ⅵ)溶液在345 nm附近没有荧光峰，表明Cr(Ⅵ)溶液不会产生与BSA相互干扰的荧光。将BSA的量固定，加入Cr(Ⅵ)后BSA的荧光发生猝灭，且随着体系中Cr(Ⅵ)浓度增加，BSA的内源荧光猝灭程度随之增强。BSA荧光猝灭过程的特征进一步表明，Cr(Ⅵ)与BSA之间存在相互作用，BSA的空间构象发生了改变。

2.2 Cr(Ⅵ)对BSA荧光猝灭机理的推断

2.2.1 荧光猝灭方式的确定

荧光猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭。假设Cr(Ⅵ)对BSA荧光猝灭的方式为动态猝灭。将猝灭数据代入动态猝灭方式所遵循的Stern-Volmer方程[21]：

F0/F=1+Ksvc=1+Kqτ0。

(2)

式(2)中：F0表示无猝灭剂时蛋白的荧光强度；F表示有猝灭剂时蛋白的荧光强度；c表示猝灭剂浓度；Ksv表示猝灭常数；Kq表示荧光猝灭速率常数，各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010L·mol-1·s-1；τ0表示猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命，生物大分子的平均寿命约为10-8s。

根据不同温度下的猝灭反应参数，以F0/F对猝灭剂浓度c作图(图2中插图)，所得结果如表1所示。

动态猝灭是由激发态分子扩散碰撞发生相互作用所致，并不影响蛋白质结构和生理活性，主要依靠扩散速率，其猝灭常数随温度升高而增大。静态猝灭是基态时生成不发光的超分子复合物，可影响蛋白质的二级结构和生理活性，升高温度会降低复合物的稳定性，因此静态猝灭常数将随温度升高而减小[22]。由表1中Cr(Ⅵ)-BSA体系线性方程(R2>0.99)可知，本试验所得Kq值远大于各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数(约为2.0×1010L·mol-1·s-1)，且Kq值随着温度的升高而有所降低，与由扩散和碰撞引起的动态猝灭规律不相符，因此推断BSA的猝灭可能是因形成基态复合物而引起的静态猝灭。

2.2.2 表观结合常数与结合位点数

Cr(Ⅵ)与BSA结合时，其结合常数与结合位点数可由式(3)[20]求出：

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlgc，

(3)

式(3)中：n为结合位点数；Kb为表观结合常数。

通过lg[(F0-F)/F]对lgc作图，根据直线的斜率和截距即可求出Cr(Ⅵ)与BSA的结合位点数n和表观结合常数Kb(表2)。

由表2中拟合的线性方程(R2>0.98)可知，Cr(Ⅵ)与BSA存在较强的相互作用，随着温度升高，Cr(Ⅵ)与BSA的结合常数Kb逐渐降低，生成复合物的稳定性降低，进一步证明Cr(Ⅵ)与BSA的荧光猝灭类型为静态猝灭，且结合位点数为1。

表1 Cr(Ⅵ)与BSA在不同温度下的猝灭反应参数Table 1 Quenching parameters of Cr(Ⅵ)-BSA system at different temperature

表2 Cr(Ⅵ)与BSA在不同温度下的表观结合常数和结合位点数Table 2 Apparent binding constants and binding sites of the Cr(VI)-BSA system at different temperature

2.2.3 作用力类型的确定

假设在测定温度范围内焓变△H变化不大，△H和△S(熵变)可以从Vant’s Hoff方程[23]求得：

lnK=-ΔH/RT+ΔS/R。

(4)

式(4)中：R=8.314 5 J·mol-1·K-1；K等同于表观结合常数Kb。

自由能变△G由式(5)求得：

ΔG=ΔH-TΔS。

(5)

分子间的相互作用力一般包括氢键、静电引力、范德瓦耳斯力和疏水力。根据反应前后热力学焓变△H和熵变△S的相对大小，可以判断分子间的作用力类型。经以下热力学规律判断小分子物质与蛋白质等大分子物质间的结合力[24]：

△H>0，△S>0，为疏水作用力；

△H<0，△S<0，为氢键力和范德瓦耳斯力；

△H<0，△S>0，为静电引力。

表3的结果显示：△H=-53.528 kJ·mol-1<0，△S=-0.110 kJ·mol-1·K-1<0，表明Cr(Ⅵ)与BSA反应体系的作用力为氢键力和范德瓦耳斯力。吉布斯自由能变△G298=-20.837 kJ·mol-1，△G308=-19.740 kJ·mol-1，△G313=-19.191 kJ·mol-1，均小于0，表明Cr(Ⅵ)与BSA体系相互作用发生反应为自发过程。同时，△H<0表明反应放热，温度的升高不利于Cr(Ⅵ)与BSA复合物的形成，因此升温将导致Cr(Ⅵ)与BSA的静态猝灭常数减小，生成复合物的稳定性降低，这也再次证明Cr(Ⅵ)与BSA的荧光猝灭类型是形成基态复合物导致的静态猝灭。

表3 Cr(Ⅵ)与BSA在不同温度下的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of Cr(Ⅵ)-BSA system at different temperature

2.2.4 结合距离的确定

根据Forster非辐射能量转移理论，非辐射能量转移的发生条件是：(1)供体的荧光发射光谱和受体的紫外吸收光谱之间有充分的重叠面积；(2)供体和受体之间的距离r小于7 nm，且0.5R0

(6)

(7)

(8)

式(6)～(8)中：E为能量转移效率；F0和F分别是加入能量受体前后供体的荧光强度；K2、n、φ分别是偶极空间取向因子、介质折射常数、BSA的荧光量子产率；J是供体的荧光发射光谱同受体吸收光谱的重叠面积；F(λ)是在波长λ下供体的荧光强度；ε(λ)是在波长λ下能量受体的吸收系数。本实验的供体和受体分别是BSA和Cr(Ⅵ)(图3)。对于BSA，K2=2/3，n=1.336，φ=0.118。经计算，E=9.76%，r=0.14 nm，R0=0.096 5 nm，符合非辐射能量转移的发生条件。因此，Cr(Ⅵ)与BSA的结合距离是0.14 nm，为非辐射能量转移。

2.2.5 结合位点的确定

为了确定Cr(Ⅵ)与BSA具体的结合位置，采用位点竞争取代实验确定结合位点[26]。BSA包括2个主要的结合位点——site Ⅰ和site Ⅱ。本实验选用保泰松和布洛芬作为位点竞争实验的试剂，以测定其对供体和受体结合常数的影响，从而确定受体的结合位点(表4)。结果表明，布洛芬的加入对BSA-Cr(Ⅵ)体系的结合常数影响较大，故可初步确定BSA与Cr(Ⅵ)的结合位点为site Ⅱ。

BSA和Cr(Ⅵ)的浓度分别为1.0×10-7、1.0×10-5 mol·L-1。Concentrations of BSA and Cr(Ⅵ) were 1.0×10-7， 1.0×10-5 mol·L-1， respectively.图3 BSA荧光发射光谱与Cr(Ⅵ)紫外吸收重叠谱图Fig.3 Fluorescence emission spectrum of BSA and ultraviolet absorption spectrum of Cr(Ⅵ)

表4 Cr(Ⅵ)-BSA体系中加入探针试剂前后结合常数的变化Table 4 Comparative assessment of binding constants of Cr(Ⅵ)-BSA system before and after addition of site probes

2.3 Se(Ⅳ)-BSA体系光谱特征

2.3.1 Se(Ⅳ)-BSA结合的紫外光谱特征

如图4所示，加入Se(Ⅳ)后，BSA的紫外吸收光谱上无明显变化。这说明Se(Ⅳ)与BSA分子未发生较强的相互作用，单独加入Se(Ⅳ)对BSA的构象并无显著影响。

2.3.2 Se(Ⅳ)-BSA结合的荧光光谱特征

对Se(Ⅳ)-BSA结合的荧光光谱特征进行观察。如图5所示：Se(Ⅳ)的加入并不能使BSA的荧光呈现有规律的猝灭.Se(Ⅳ)与BSA的作用没有明显的荧光猝灭现象，表明单独加入Se(Ⅳ)对BSA几乎无影响。

2.4 Se(Ⅳ)对Cr(Ⅵ)-BSA体系光谱特征的影响

2.4.1 Se(Ⅳ)对Cr(Ⅵ)-BSA体系紫外光谱特征的影响

BSA浓度为1.0×10-5 mol·L-1。图中1～7指示的Se(Ⅳ)浓度分别为0、0.2×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-5 mol·L-1. Lines 1-7 indicated solutions with Se(Ⅳ) concentrations of 0， 0.2×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.图4 Se(Ⅳ)与BSA结合的紫外吸收光谱特征Fig.4 Characteristics of ultraviolet absorption spectrum of Se(Ⅳ) in combination with BSA

BSA浓度为1.0×10-7 mol·L-1。图中各曲线的Se(Ⅳ)浓度分别为0、0.1×10-4、0.2×10-4、0.3×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-7 mol·L-1. Lines indicated solutions with Se(Ⅳ) concentrations of 0， 0.1×10-4， 0.2×10-4， 0.3×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.图5 Se(Ⅳ)与BSA结合的荧光吸收光谱特征Fig.5 Characteristics of fluorescence spectrum of Se(Ⅳ) in combination with BSA

BSA、Cr(Ⅵ)、Se(Ⅳ)的浓度分别为1.0×10-5、0.8×10-4、0.8×10-4 mol·L-1。Concentrations of BSA， Cr(Ⅵ) and Se(Ⅳ) were 1.0×10-5， 0.8×10-4， 0.8×10-4 mol·L-1， respectively.图6 Se(Ⅳ)对BSA-Cr(Ⅵ)体系紫外光谱的影响Fig.6 Effect of Se(Ⅳ) on ultraviolet absorption spectrum of BSA-Cr(Ⅵ) system

如图6所示，由于Cr(Ⅵ)的加入，BSA紫外吸收光谱中220 nm处的特征峰增强，表现为增色效应，且峰位红移，而在280 nm处的吸收光谱未发生显著变化，说明Cr(Ⅵ)与BSA蛋白分子外部的一些维持骨架结构的基团(如羟基、氨基、巯基)发生作用使骨架结构松散，链状结构展开。Se(Ⅳ)的加入并未使体系表现出显著的变化，表明加入Se(Ⅳ)对Cr(Ⅵ)-BSA体系的紫外光谱特征未造成影响。

2.4.2 Se(Ⅳ)对Cr(Ⅵ)-BSA体系荧光光谱特征的影响

对Se(Ⅳ)加入Cr(Ⅵ)-BSA体系后的荧光光谱特征进行观察。如图7所示：当Cr(Ⅵ)浓度为0时，随着Se(Ⅳ)浓度的增加，BSA的最大荧光峰出现在345 nm附近，荧光强度在230～247 nm无规律波动；当Cr(Ⅵ)浓度为0.8×10-4mol·L-1时，荧光强度显著降低，随着Se(Ⅳ)浓度的增加，BSA的最大荧光峰出现在338 nm附近，荧光强度在143～151 nm无规律波动，表明Cr(Ⅵ)能改变BSA的构象，但加入Se(Ⅳ)对Cr(Ⅵ)造成的BSA荧光猝灭无影响。

3 讨论

BSA浓度为1.0×10-7 mol·L-1。图中相同Cr处理下各曲线的Se(Ⅳ)浓度分别为0、0.1×10-4、0.2×10-4、0.3×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4 mol·L-1。Concentration of BSA was 1.0×10-7 mol·L-1. Lines under the same Cr treatment indicated solutions with Se(Ⅳ) concentrations of 0， 0.1×10-4， 0.2×10-4， 0.3×10-4， 0.4×10-4， 0.8×10-4， 1.2×10-4， 1.6×10-4， 2.0×10-4 mol·L-1， respectively.图7 Se(Ⅳ)对BSA-Cr(Ⅵ)体系荧光光谱的影响Fig.7 Effect of Se(Ⅳ) on fluorescence emission spectrum of BSA-Cr(Ⅵ) system

蛋白质构象的变化主要表现为蛋白质紫外吸收光谱吸收峰的峰强或峰位的变化，本实验借此来判断小分子物质对蛋白质荧光的猝灭机理，利用紫外可见吸收光谱法计算小分子与蛋白质作用的结合常数和结合位点数，运用荧光猝灭法研究小分子物质与蛋白质的相互作用[27-28]。实验中所选的BSA属于血清白蛋白，具有重要的生理功能，可与许多内源性和外源性化学物质以不同的方式结合[29-30]。同时，它与人血白蛋白(HAS)结构相似，性质却较为稳定，价格更为低廉，已成为研究小分子物质与生物大分子相互作用的理想蛋白质模型并得到了广泛应用[31]，成为重金属与蛋白质作用研究的首选[32]。

为保证实验的可比性和可重复性，在前人研究的基础上[6，20，22]，首先，在统一的实验条件下，对Cr(Ⅵ)-BSA、Se(Ⅳ)-BSA结合机理进行了更加深入、更加全面的探讨，为进一步研究Se(Ⅳ)对BSA-Cr(Ⅵ)体系的影响奠定了基础。本实验中Cr(Ⅵ)-BSA结合的紫外光谱220 nm处的吸收峰主要是由肽键上羰基的n-π*电子跃迁引起的，280 nm处的吸收峰则主要是由BSA分子中色氨酸和酪氨酸的芳香杂环π-π*和n-π*电子跃迁引起的[33]。随着Cr(Ⅵ)浓度加大，它们与BSA分子发生相互作用，造成BSA构象改变，从而导致其微环境发生变化，反映到光谱特征上表现为BSA反应体系的紫外吸收光谱220 nm处峰位红移，吸光度增加。Se(Ⅳ)-BSA结合的紫外光谱并未观察到显著变化。这表明Se(Ⅳ)与BSA分子未发生较强的相互作用，Se(Ⅳ)与BSA不能进行有效的结合，从而证明Se(Ⅳ)没有造成BSA分子特征的显著变化，Se(Ⅳ)的加入对BSA的构象并无显著影响。

对Cr(Ⅵ)-BSA、Se(Ⅳ)-BSA结合的荧光光谱特征进行观察和分析，发现Cr(Ⅵ)的加入能够猝灭BSA的特征荧光，猝灭程度随着Cr(Ⅵ)浓度的增大而增强。这一现象是由于生成了不发荧光的基态配合物[34]。而Se(Ⅳ)的加入并不能使BSA的荧光呈现有规律的猝灭，即Se(Ⅳ)与BSA的作用没有明显的荧光猝灭现象，表明Se(Ⅳ)的加入对BSA几乎无影响。这可能是由于Se(Ⅳ)与BSA的作用力比较弱[35]，无法与BSA蛋白有效结合。

向BSA-Cr(Ⅵ)体系中加入Se(Ⅳ)，未观察到Se(Ⅳ)对BSA的空间构象和光谱特征产生显著影响。根据沈芳[35]对Hg(Ⅱ)、Se(Ⅳ)与BSA相互作用的研究，当Hg(Ⅱ)与Se(Ⅳ)同时加入时，BSA的二级结构有微弱变化，且变化极小，没有单独加Hg(Ⅱ)时的变化明显。对比本实验中Se(Ⅳ)对BSA-Cr(Ⅵ)体系的构象并无显著影响的结果分析，可能是由于Cr(Ⅵ)首先加入反应体系，先与蛋白质巯基结合，导致Se(Ⅳ)的加入无法再次引起BSA的构象改变。

综上所述，Cr(Ⅵ)能与BSA分子发生较强的相互作用，与BSA进行有效的结合，而Se(Ⅳ)与BSA的作用力较弱，不能进行有效的结合，且Se(Ⅳ)的加入对Cr(Ⅵ)与BSA的结合并无显著影响。同时，本实验分析得出了Cr(Ⅵ)与BSA分子作用的相关参数和结合方式。研究结果可为Cr(Ⅵ)、Se(Ⅳ)与蛋白质结合的分子机制研究提供借鉴，从而为研究Cr(Ⅵ)的毒性机制和Se(Ⅳ)对蛋白质的作用机理提供理论参考。