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非密闭系统中芦笋老茎的水解特性研究

2020-03-07徐苏云崔铭昊李勤锋王宇磊

浙江农业学报 2020年1期
关键词:芦笋菌剂水解

徐苏云,崔铭昊,燕 燕,李勤锋,王宇磊

(1.上海理工大学 环境与建筑学院,上海 200093; 2.平湖市农业农村局,浙江 平湖 314200)

芦笋因其良好的口感和质地,以及富含维生素、类黄酮、酚酸和膳食纤维等高生物活性化合物而被广泛食用。2012年中国芦笋生产面积13.3万hm2,占全球芦笋栽培面积的50%以上,仅鲜笋的总产值就达150亿元以上[1]。芦笋主要作为蔬菜食用,可食用部分嫩茎仅占整株生物学产量的2/3,近40%茎叶被浪费。采摘季节过后,芦笋将继续生长,地上茎的高度可达180~250 cm,这部分茎被称为芦笋老茎。芦笋老茎的主要成分是木质素、半纤维素和纤维素,可加工为饲料,但由于近年来我国部分地区的畜牧业受到限制,大量的芦笋老茎在采摘季节后被丢弃,任其腐败或就地焚烧,既污染环境又造成资源的浪费。因此,寻找一种合理的芦笋老茎处理方式,提高芦笋整株的利用价值,已成为芦笋种植户和芦笋加工企业亟待解决的问题。

一般认为,富含纤维素的作物残留物约占农业废物干质量的50%。纤维素的生物降解是生物圈碳循环的重要组成部分,具有生产生物燃料或化学品生物产品的潜力[2]。如果将这些富含纤维素的农业废弃物用于厌氧消化,可以产生大量的沼气和稳定的肥料。然而,纤维素类有机物在厌氧消化过程中分解缓慢[3]。大量研究表明,细菌和真菌等外源微生物的接种可以分泌纤维素酶,加速水解过程中纤维素的生物降解[4],可用于厌氧消化的水解预处理阶段。

相关研究表明,在密闭的厌氧环境下,水解是农业废弃物的限速步骤。在有氧环境中,有机物水解的能力明显超过厌氧环境[5]。微好氧环境可促进微生物发酵,显著提高纤维素的分解效率。近年来,国内外开始将非密闭系统应用于农业废弃物的水解,对传统的连续搅拌槽反应器(CSTR)稍加改动,利用被动通气或向反应器内铺设通气装置的方法来达到调节溶解氧(DO)浓度的目的。微好氧是介于好氧和厌氧之间的状态。通常认为,微好氧环境的DO在0.2~1 mg·L-1,好氧状态的DO在2 mg·L-1以上,而传统的厌氧发酵体系中DO低于0.2 mg·L-1。研究发现,适当的曝气量不仅可以增加纤维素酶活性、促进固体有机废弃物的水解[6],同时还可减少因过度曝气而产生的碳损失[7]。

在富含纤维素的农业废弃物降解过程中,会形成腐殖质类物质(HS)等复杂的非均相有机化合物[8]。研究表明,HS中的多种官能团会对厌氧发酵过程中的发酵细菌水解酶和蛋白酶起到破坏作用,导致复杂有机物质水解出现障碍。此外,高含量的黄腐酸也会对厌氧消化池中的甲烷古菌产生不利影响[9]。至今,关于水解过程中HS产生机理的研究报道较少。本研究拟探讨蔬菜废弃物芦笋老茎在非密闭系统中的水解情况,考查接种量和曝气操作对其纤维素水解和HS生成的影响,以期为相关研究提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 原材料和接种物

以浙江平湖某农场的芦笋老茎为研究对象。芦笋老茎的含水量为91.05%,挥发性固体(VS)与总固体(TS)的比值为94.39%,干固体纤维素含量为27.06%。水解菌剂是以土壤为菌种来源,以纤维素为碳源,经过分离、扩增、驯化培育出来的混合菌剂,包含芽孢杆菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌,1 g菌剂中约含有活菌5×1010,以CMC-Na液体培养基测试该菌剂的纤维素酶活性为43.02 U·g-1,表明该菌剂具有较高的纤维素降解能力。

1.2 实验设置

采用1 L敞口锥形瓶作为非密闭水解酸化装置。与传统的密闭发酵反应器相比,该装置上盖不密封,允许空气自由进出。实验共设置1个对照组(CK)和4个接种组(Run 1~4),每组投加100 g 芦笋老茎(颗粒粒径约1 cm)、500 mL去离子水,各补充1 g尿素作为氮源。对照组未接种微生物;Run 1~3中依次添加0.1、0.3、0.5 g的菌剂;Run 4 在Run 2基础上曝气,曝气速率设置为2 L·min-1,保持水解液DO在0.5~2 mg·L-1。每处理设置2个平行,水解反应在35 ℃持续12 d。实验过程中,每2 d取10 mL的混合物样品,10 000 r·min-1离心6 min,然后用0.45 μm针式过滤器过滤,滤得上清液储存待测。

1.3 分析方法

所采集的液体样品采用总有机碳(TOC)分析仪(Jena/3100)检测总凯氏氮(TKN)和TOC含量。在消化结束时收集残留物,分别确定TS降解率和纤维素降解率(DRC)。固体纤维素含量和官能团变化采用红外光谱分析仪(FITR,ThermoFisher Nicolet iS10,美国)进行分析,光谱范围为4 000~400 cm-1,分辨率为4 cm-1,取波数1 425 cm-1为纤维素特征峰,参考峰2 133 cm-1为硫氰酸钾的特征峰,计算D1425/D2133,与纤维素标准曲线定量比较得到样品的纤维素含量[10]。

水解液中溶解性有机物组分采用三维荧光光谱仪(3D-EEM,日本日立F-7000FL)表征:在标准溶液中配置不同浓度的腐植酸和黄腐酸,利用3D-EEM进行分析,以区域单位荧光强度为纵坐标,在横坐标上绘制相应的腐植酸和黄腐酸含量,绘制校准曲线,对荧光数据进行处理,计算腐殖化指数(HIX)和荧光指数(FI)[11]。

利用发芽指数(GI)对水解中间产物的生物毒性随水解时间的动态变化进行评价。取10 mL水解液和20粒水芹种子置于玻璃培养皿,放入25 ℃的培养箱中培养,5 d后对发芽种子数量和发芽种子的根茎长度进行计数。

2 结果与分析

2.1 固体分解和消化产物的表征

图1所示为各实验组的TS降解率和DRC。经过12 d的水解,各实验组的TS降解率从低到高依次为CK(35.05%)

图1 不同处理下芦笋老茎的TS降解率和DRCFig.1 TS degradation rate and DRC of asparagus old stem

图2 各实验组未处理样品和水解后残留物的红外光谱Fig.2 FTIR spectra of raw material and residues after hydrolysis in each group

2.2 水解产物中有机物的变化

水解过程中pH、TOC、TKN的变化如图3所示。各实验组的初始TOC在1 800~1 900 mg·L-1,在水解过程中,从开始到第2天,Run 1~4的TOC分解效率高于CK,可能是由于易分解的有机物成为供微生物呼吸生长的能量和物质来源。在相同的接种率下,Run 4的分解效率高于Run 2,2 d水解后,其TOC值从1 890 mg·L-1的初始值下降到413 mg·L-1;到12 d水解结束时,Run 4的TOC降至282 mg·L-1,说明较为充足的氧气可以促进水中好氧微生物的分解代谢和合成代谢过程,从而提高水解效果。

各实验组TKN的含量随水解过程先升高后降低。其中,Run 1~3在0~6 d的水解过程中快速增加,分别达到147、173、169 mg·L-1。这可能与底物含氮物质如蛋白质的水解有关。与此同时,微生物在水解初期利用外加氮源合成分泌大量的胞外水解酶进入到液相,对TKN也有一部分贡献。经过6 d的水解,各实验组的TKN下降,说明蛋白质等物质逐渐分解、氨氮逐渐转化为硝态氮[13]。Run 4的TKN含量从一开始就处于较低水平,这可能与好氧微生物的高活性和同化作用对氮的利用有关[14]。

图3 水解液中pH、TOC和TKN的变化Fig.3 Changes of pH, TOC and TKN in hydrolysate

2.3 水解液荧光特性的变化

HS是在有机物的衰变和转化过程中形成的复杂的非均相有机化合物[10]。不同来源的溶解有机物或HS具有不同的荧光团,荧光峰的位置和荧光强度也不同[15]。一般来说,腐植酸类物质(HA)荧光区为350~440 nm和430~510 nm,而黄腐酸类物质(FA)荧光区为310~360 nm和370~450 nm[16]。水解过程中,HA和FA质量浓度的变化如图4所示。随着芦笋老茎的分解,HA和FA都增加,且增加幅度高于CK。HA和FA质量浓度的增加可能与活性微生物和酶作用下纤维素材料转化为HS有关。Run 1~4中FA的质量浓度高于CK,但增加幅度小于HA。水解第2天,Run 4中的FA质量浓度上升到最大值1.37 g·L-1,之后持续下降直至水解结束,最终Run 1~4中的FA质量浓度达到了类似的水平。Run 4中后期FA的降低与HA的增加相对应,HA的结构比FA更复杂、更稳定,同时FA可以被微生物分解转化为HA[17]。水解结束时,接种组的HA质量浓度高于对照组,而FA的质量浓度低于对照组,说明菌种接种和曝气操作加速了TOC和纤维素的降解,同时增加了HS含量。关于HS的形成机制有多种假设,其中一种广为接受的假设是糖胺缩合理论,即糖和胺通过一系列复杂的糖胺缩合反应合成HS的关键成分[18]。通过对HS含量和DRC的观察,Run 4中分解的纤维素越多,HS的含量越高,间接说明接种菌剂和曝气均可以促进纤维素和多糖向HS的转化。

考查HIX和FI的变化规律,结果如图5所示。HIX表征腐殖化程度,通常而言,HIX值越高,腐殖化程度越高[19]。在水解的第6天后,Run1~3的HIX指数上升较快,表明在水解的中后期阶段,接种菌剂有利于低腐殖度组分转化为高腐殖度组分。水解结束时,Run 1~4的HIX值均高于CK,说明接种可以加速腐殖化进程,缩短腐殖时间。本研究中各实验组的HIX值均低于4。有研究表明,当HIX值小于4时,溶解有机质(DOM)主要由自发来源引起,即主要由微生物活性引起[20]。FI指数用于表征荧光DOM中腐殖成分的来源,当FI>1.9时,表明类腐殖质主要源于微生物代谢活动[21]。在水解的第2天,各实验组的FI指数均有大幅度增加,说明实验组中接种微生物与土著微生物都得到了活化并作用于水解反应,Run 1~3和CK组的FI值在2.5~2.8,Run 4的FI指数在3.5~3.7,说明Run 4的自生源特性更加强烈,这可能是由于Run 4接入曝气后,充分刺激了接种微生物的活性。

图4 HA和FA在水解过程中的变化Fig.4 Changes of HA and FA during hydrolysis

图5 HIX和FI在水解过程中的变化Fig.5 Changes of HIX and FI during hydrolysis

图6 水解过程中GI的变化Fig.6 Changes of GI during hydrolysis

2.4 发芽指数分析

如图6所示,各实验组的发芽指数随水解时间延长而逐渐增加,比较而言,接种组的GI较对照组增加更快。在水解结束时,各组的GI从高到低依次为Run 4(93.2%)>Run 2(79.5%)>Run 3(74.6%)>Run 1(68.2%)>CK(60.2%)。这表明在水解过程中接种菌剂对芦笋老茎中有害物质的分解是有效的。在本研究中,Run 4的GI值比其他处理组增加得更快,这可能是由于在曝气条件下氨和有机酸等植物毒性物质加速分解,水解液中有毒物质减少[22]。将GI指数、FI和HIX进行双变量Pearson相关性分析(SPSS Statistics V25软件),发现GI指数与HIX相关性达极显著水平(P<0.01),说明腐殖化程度越高,生物毒性越低。从水解液的各项指标来看,水解液亦可作为植物灌溉水回用于蔬菜种植。

3 结论

本研究使用不同剂量的纤维素菌剂来促进芦笋老茎的水解。与CK相比,接种可显著加速纤维素的分解并增加腐殖化程度。综合比较水解液各项指标,当菌剂接种比为0.3%时,水解效果较好,处理12 d后芦笋老茎总固体的最大分解率为75.43%。适当增加曝气提供微好氧环境,可提高水解产物的腐殖化程度。HIX与GI呈极显著正相关,第12天时Run 4水解液的HIX接近3.0,GI指数为93.2%。该结果表明,非密闭系统的兼性水解可以独立应用于蔬菜废弃物的分散式减量化和稳定化处理。

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