材料表面微结构对破骨细胞调控作用的研究进展

谭艳林 张强 刘秀飘 熊博凯 杨佩佩 杨羽晨

南昌大学第一附属医院口腔颌面外科330006

0 引言

常见外伤、肿瘤、先天畸形等疾病常易导致颌骨缺损，如何有效重建颌骨缺损及恢复患者的口颌系统功能是口腔颌面外科医生面对的主要挑战之一。机体具有自身修复功能，可修复范围较小的颌骨缺损，但对于范围较大的复杂颌骨缺损，则很难完成缺损区的骨修复重建[1]。此时，有赖于一些特殊的治疗手段，包括牵张成骨术、自体骨移植、骨替代生物材料等。目前常见的骨修复重建手段均有较为明显的缺点，例如牵张成骨术较适合长骨类型的修复，对于形态复杂的骨缺损修复效果较差，且修复过程复杂而周期长[2]；自体骨移植作为骨缺损修复的“金标准”，存在手术创口较多及骨来源部位受限等弊端[3]。

近年来，随着材料学及骨组织工程学的快速发展，具有优良性能的骨替代材料已广泛应用于临床[4]。Urist[5]在1965年首先发现了材料的骨诱导现象，成为骨诱导研究领域的里程碑。骨诱导性是指生物材料植入体内后诱导组织间充质细胞分化为成骨细胞并最终形成骨组织的能力[6]。之后诸多学者通过不同材料在不同动物体内的实验验证了材料表面微结构诱导成骨的现象。包崇云和张兴栋[7-8]在此基础上提出了“体内组织工程学”概念，克服了种子细胞不稳定的缺陷，由此骨诱导性材料的研究成为热点。目前多数研究集中于材料表面微结构对成骨细胞的作用方面，而破骨细胞在骨代谢和骨重建过程中具有重要作用，关于材料微结构对破骨细胞的作用及调控方面报道很少。本文就材料表面微结构对破骨细胞的影响进行综述。

1 破骨细胞在骨组织工程中的作用

骨组织工程的发展，其最终目的是基于骨生理，在材料植入部位重演骨修复的过程，达到具有天然骨结构和功能的再生。目前骨组织工程已取得了很大进步，种子细胞及新型支架材料的研发均推动着骨组织工程的发展。但依然存在许多问题，最主要的问题是体外培养的成骨细胞与体内成骨细胞存在着功能及形态差异，其形成的骨组织因结构不良而不能应用于临床负重骨缺损的修复。研究结果表明，缺乏破骨细胞的调节作用，骨发育过程中的成骨细胞行为会出现异常，导致骨基质排列紊乱及矿化缺陷。而大量研究结果也证实破骨细胞的缺失可导致体外骨形成异常[9-12]。因此，引入破骨细胞是解决目前骨组织工程中面临问题的必不可少的途径。

基于骨重塑的生理机制，破骨细胞与成骨细胞的相互作用在骨重塑过程中至关重要，其主要通过细胞间直接接触、分泌旁分泌因子间接调控以及骨基质的桥梁作用这3种方式进行相互调节。破骨细胞对成骨细胞的调控作用在骨组织工程中尤为重要，破骨细胞的形成是材料骨诱导的先决条件[13-14]，其通过表达和分泌信号分子（如甲状旁腺激素、类胰岛素生长因子、骨形态发生蛋白和β-转化生长因子）影响成骨细胞行为并诱导成骨[15]。

此外，随着再生医学向精准医学的转变，骨再生倾向于完全恢复原来的组织，这就要求骨移植替代物具有骨诱导性的同时，其自身可被吸收[9,16]，在一定时间内被吸收并被新生骨组织替换，即骨重塑在植入部位的重演。而人工合成的骨移植替代物的降解主要依赖两条途径，即物理化学溶解和细胞介导的吸收作用。不同的材料其降解方式不同，降解速度也各异。例如人工合成磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）的化学降解作用比细胞介导的吸收作用更快，而天然骨移植替代物和羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）则主要依赖于破骨细胞的吸收机制[17-18]。破骨细胞是唯一能吸收骨组织和支架材料的细胞[19-20]。关于材料降解速度的差异化问题一直未得以解决，支架材料降解太快会过早丧失骨诱导性及骨传导功能，不利于新骨形成；降解太慢则不利于骨重塑及骨完全再生。目前各种支架材料的最佳降解速率尚需进一步研究。

由此可见，破骨细胞与成骨细胞一样，在骨组织工程中的作用不容忽视。短期内，破骨细胞的引入可维持支架孔隙度以利于移植后的血管神经重建以及材料内部营养供应；而破骨细胞对成骨细胞的调控，对于类板层骨结构的形成及临床应用推广有着更深远的意义。目前，对于成骨细胞在骨组织工程中的应用已进行了广泛研究，而破骨细胞的作用往往被忽略，尚需深入研究。

2 材料表面微结构对破骨细胞的调控作用

破骨细胞对植入材料的吸收作用在再生医学中至关重要，同时，材料的理化性质亦会影响破骨细胞的行为。细胞与材料之间的反应包含复杂的生物学相互作用，其受材料表面物理化学特性的影响，特别是表面物理微观形貌，纳米和微米级的粗糙度均可影响细胞黏附、增殖分化及相关信号通路的调节[21]。在骨组织工程中，改变支架材料的表面物理微观形貌，是提高植入物和支架材料生物学性能的直接而有效的途径。

目前，材料微结构在启动骨诱导性过程中的关键作用已被大多数研究者所接受[22-26]。基于破骨细胞和成骨细胞在骨重塑中的耦合机制[9,27]，在材料微结构对成骨细胞的调控研究基础上，有少量文献报道了材料微结构对破骨细胞的影响，指出不同材料、不同微结构（即尺寸范围、几何形状和表面参数等）均会影响破骨细胞的行为[28-29]。体内外研究结果显示，材料表面物理参数（表面的微观结构和宏观结构）对于促进植入部位破骨细胞的生成和触发异位骨形成意义重大[30]。

2001年Webster等[31]首次研究了陶瓷表面纳米/微观结构对破骨细胞功能的影响，发现除材料化学组成和溶解度外，表面纳米/微米级结构亦影响破骨细胞的生成，表明材料表面物理微观形貌可调控破骨细胞行为。之后大量研究结果也证实在材料的化学成分、孔径、孔隙率均相同时，材料表面微观形貌影响着支架材料的可吸收性，其对破骨细胞生存及活化具有重要影响[32]。

在控制了材料化学成分、物理结构（包括孔隙率、孔径等）等可影响破骨细胞功能的其他因素后，材料表面微结构对破骨细胞可产生重要影响。其中材料表面粗糙度可影响破骨细胞行为，包括破骨分化及破骨吸收功能等，但具体机制尚无明确定论。关于表面的“粗糙”或“光滑”尚无清晰定义，且究竟粗糙度在何范围内促进破骨细胞行为，何范围内抑制破骨细胞行为，亦无明确界定。

Hayes等[21]分析粗糙的定义主要取决于细胞的尺寸大小，包括平均粗糙度和波峰间距；在粗糙度Ra＞2 μm时，若波峰间距大于等于成骨细胞大小，则成骨细胞表现为光滑平面上成纤维细胞样形态；反之，则成骨细胞不能铺展并表现为典型的成骨细胞形态。由于成骨细胞（细胞直径平均为10 μm）与破骨细胞（细胞直径可达20～100 μm）尺寸大小不一，故同一种结构对成骨细胞与破骨细胞可产生明显不同的影响。Costa等[33]发现，微粗糙的HA3[Ra=363 nm（原子力显微镜）或 2 μm（轮廓测定法）]有利于成骨细胞的黏附，能显著促进成骨细胞分化，但不利于黏着斑形成；而光滑的HA1[Ra=194 nm（原子力显微镜）或1 μm（轮廓测定法）]上破骨细胞黏附率是粗糙的HA3上黏附率的2.5倍，且破骨细胞吸收功能活性也较HA3强。

在Matsunaga等[34]的研究中，当大鼠破骨细胞于不同粗糙度的骨片上培养时，在Ra=1.0 μm时骨片吸收率最大；在Ra=2.9 μm时，骨片吸收量减少约20%。Costa-Rodrigues等[35]在烧结的HA上培养人外周血单个核细胞，并采用核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）诱导破骨分化，发现在较粗糙的表面上形成了更多的破骨细胞，其Ra值均＜2μm（Ra在0.0437～0.582 0 μm）。Davison等[20]比较了TCPs（Ra=0.126 μm）与TCPb（Ra=1.287 μm）上RAW264.7细胞的破骨分化，发现TCPs表面上形成的破骨细胞数是TCPb的2 倍，且 TCPb未被吸收。综合分析，Ra在 0.1～1.0 μm时，破骨细胞黏附、分化及吸收功能最强；但这个区间跨度仍然太大，具体的Ra值范围以及各种材料之间（骨片、HA、TCP、钛金属等）的差异尚需进一步研究。

3 材料表面微结构对破骨细胞的调控机制研究

3.1 材料表面微结构对破骨细胞增殖与分化的影响

自20世纪90年代中期发现RANKL-核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factorκB,RANK）-骨保护素（osteoprotegerin,OPG）系统以来，破骨细胞形成和激活主要通过RANKL-RANKOPG轴实现已成为共识[36]。破骨细胞的增殖与分化依赖于巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor,M-CSF）和RANKL的协同作用。RANKL与RANK结合及其诱导破骨前体细胞分化为破骨细胞的过程受不同的蛋白与激酶调节，主要包括肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosisfactor receptor-associated factor 6，TRAF6）、核因子κB、激活蛋白-1、T细胞核因子1、整合素信号等。

细胞表面RANK-RANKL接触机制在破骨细胞的分化过程中是必需的[37-38]。材料表面微结构这一外界物理刺激对破骨细胞的调控作用同样依赖于细胞-基质的相互接触。破骨细胞黏附于细胞外基质以及细胞-细胞接触主要是通过整合素αvβ3介导实现的[39-41]。阻断整合素αvβ3会导致破骨细胞黏附减少[42-43]。Kim等[44]发现，M-CSF和OPN通过整合素αvβ3依赖性途径促进破骨细胞黏附和扩散，依靠整合素αvβ3通过“内向外”信号传导和“外向内”信号传导进行。M-CSF和RANKL在破骨细胞的成熟及分化中均起着重要作用，两者协同促进破骨细胞的形成与分化，RANKL可提高破骨细胞膜表面整合素αvβ3的表达，M-CSF则通过整合素αvβ3传导破骨细胞前体细胞分化所需的信号，两者可通过整合素αvβ3发挥生物效应，从而调节破骨细胞的功能[45]。

在Makihira等[46]的研究中，在无RANKL诱导剂的情况下，破骨细胞分化指标抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K以及RANK、TRAF6、β-肌动蛋白（RANK、TRAF6是RANKL调控破骨分化的靶点，β-肌动蛋白作为内参）等的表达均呈粗糙依赖性增加，进一步表明材料表面粗糙度促进了RANKL介导的破骨分化。同样的，Costa-Rodrigues等[35]发现不同表面结构对破骨细胞的调控作用依赖于破骨分化诱导因子，在与M-CSF、RANKL共培养的外周血单个核细胞中破骨细胞形成反应随表面粗糙度的增加而增加；而在与人骨髓细胞共培养的外周血单个核细胞中破骨细胞形成较低，但在共培养模型中补充破骨细胞生成诱导剂后，显示出高水平或与前者类似水平的破骨细胞分化。由此可见，材料表面递增的粗糙度增强了M-CSF和RANKL诱导的破骨分化。

综上所述，破骨细胞可能通过整合素αvβ3识别材料表面微结构这一外界信号，并激活黏着斑激酶，从而启动下游信号通路，由此材料表面微结构可调控RANKL介导的破骨分化。

3.2 材料表面微结构对破骨细胞功能活性相关蛋白的影响

破骨细胞吸收功能主要在于皱褶缘形成的封闭带及肌动蛋白环的组装，破骨细胞活化的调节因子主要有整合素 αvβ3、溶酶体、Src蛋白、OPG、Ephrin/Eph和Semaphorin信号通路及相关基因突变。在破骨细胞行使吸收功能的过程中，首先是破骨细胞对基质或材料的识别、黏附，但具体机制尚不清楚。Davison等[20]发现，破骨细胞只吸收亚微米级表面结构的TCPs而不吸收微米级结构的TCPb，由此推断破骨细胞吸收功能对TCP表面结构的尺度高度敏感。

深入研究发现，材料表面不同的微结构可影响破骨细胞的肌动蛋白环、黏着斑数量及其吸收功能活性。肌动蛋白环是破骨细胞吸收装置中封闭带的主要成分，整合素αvβ3是封闭带以及黏着斑形成的重要组分，也是介导破骨细胞黏附于基质的主要蛋白[47]。αvβ3-PYK2-Src-p130是肌动蛋白环形成的必要通路[48-49]，而黏着斑激酶是该信号通路激活的关键酶[50]。Costa-Rodrigues等[51]也发现，随着HA表面粗糙度和复杂性的增加，黏着斑的数量随之降低，与此一致，微粗糙的HA3表面培养的破骨细胞，其β-肌动蛋白密封带的数量及活性也随之降低。

在上述研究中，表面结构对破骨细胞形成和功能的影响体现在破骨细胞形态、肌动蛋白环组装和吸收凹坑形成等方面，材料表面粗糙度在一定范围内可增强破骨细胞功能，但粗糙度过大反而抑制其活性。TCP亚微米级表面结构[Ra=（0.126±0.003）μm]相比于微米级表面结构[Ra=（1.287±0.011）μm]能明显激活破骨细胞功能活性[20]，而HA纳米级表面结构[Ra=（104.8±18.9）nm]相对于微米级表面结构[Ra=（241±25.1）nm]则能明显抑制破骨细胞功能活性[52]。因此，可通过精确量化各种材料表面结构，以调控支架材料上破骨细胞的肌动蛋白环形成及其吸收功能活性。

不同粗糙度的表面结构可导致培养的破骨细胞行为差异，细胞黏附、分化及吸收功能随材料表面粗糙度的变化而变化，同时检测到一些蛋白分子的表达也随表面粗糙度的变化而改变。但其内在机制均尚未清楚，具体的数量级也无明确界定，推测细胞反应的差异可能与相关细胞内信号传导途径的调节有关。未来有望通过材料表面物理微观结构对破骨细胞整合素αvβ3相关信号通路的调控阐明其作用机制，为制备性能更优异的支架材料提供参考。

4 结语

无论是体外还是体内研究，细胞与材料之间的相互作用均起于细胞与材料表面的接触，细胞在材料表面的黏附和迁移决定了细胞的增殖和分化[52]。可通过材料表面物理微观形貌调控细胞的黏附、迁移、增殖与分化以及相关基因的表达，从而影响细胞行为。

材料表面物理微观形貌尤其是粗糙度对破骨细胞的调控作用显著，Ra在0.1～1.0 μm时破骨细胞活性最强；Ra在0.2～2.0 μm时，用于光滑与粗糙表面细胞行为的对比研究最佳。关于材料微结构启动骨诱导性及骨传导性均已进行了大量研究，其中材料微结构启动骨诱导已得到证实，基于成骨细胞与破骨细胞在“体内骨组织工程”以及“再生医学”中的密切联系，材料微结构对破骨细胞的调控研究显得尤为必要。因此，未来研究可测定一个合适的Ra值范围，建立成骨细胞与破骨细胞共培养体系，通过材料表面微结构精确调控骨移植替代物植入部位的成骨细胞与破骨细胞行为，实现骨重塑，达到骨组织完全再生。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突