茶多酚对骨组织细胞的影响及其在组织工程中的应用进展

曹振 潘光玉 王丽萍 郭勇

桂林医学院生物技术学院541199

0 引 言

骨组织通过破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成的连续过程，不断再生重建[1-2]。由破骨细胞和成骨细胞的精心协作以维持适当的骨质量和数量，这种平衡受到各种激素、细胞因子和生长因子的严格调控[2]。因此，骨重建的失调可导致代谢性骨病，其主要疾病有骨质疏松症、软骨病及骨关节炎[2]。随着全世界人口年龄的增长，预期寿命的延长，老年人骨骼疾病的患病率也随之上升，生活成本大大提高[3]。骨骼疾病对患者及其家人身心均有严重影响，使其生理和心理健康受到压抑，增加大众的负担；同时也会对患者自尊心、外貌造成负面的影响[4]。

茶多酚（TeaPolyphenols，TP）是茶叶中类多羟基酚类化合物的总称，其中以儿茶素含量最多，在儿茶素成分中，表儿茶素没食子酸脂（Epigallocatechin，EGCG）是含量最丰富和药用活性最强的成分[5]。一项短期实验发现茶多酚可减轻骨丢失和改善卵巢切除术致骨质疏松大鼠的骨微结构[6]，说明茶多酚可能与骨组织相关细胞有密切联系。茶多酚具有明显的抗氧化应激和抗炎作用，而氧化应急可促进成骨细胞凋亡、破骨细胞分化[7-8]，同时炎性因子使成骨细胞上表达核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL） 刺激破骨细胞成熟[9]。由此，国内外学者预测茶多酚可以预防骨骼疾病，且能在骨组织材料中作为表面修饰物。本文旨在依据目前的多项研究，总结茶多酚在骨组织再生环境中对成骨细胞和破骨细胞生长分化的影响，以期更好地探究茶多酚在骨组织工程中的可能应用。

1 茶多酚对骨组织及相关细胞的影响

1.1 茶多酚对骨组织的影响

最近的一项调查表明，茶叶可明显降低女性骨质疏松的状况；而对于男性，由于饮酒、吸烟等不良习惯可能会降低茶叶对骨质疏松的影响[10]。经常喝茶可降低中老年男性骨质疏松性髋/股骨骨折的风险，提升中老年女性骨骼质量，并对骨几何结构具有保护作用[11-12]。

大量的动物模型和临床试验表明，茶的摄入量与维持骨密度（bone mineral density，BMD）之间存在正相关关系。给予卵巢切除术（OVX）雌性大鼠连续13周口服 60、120、370 mg/kg的绿茶提取物（green tea extract，GTE）（茶多酚是绿茶提取物的主要成分），结果表明，中剂量GTE治疗可改善OVX大鼠的股骨BMD和生物力学特性，治疗组皮质骨和骨小梁的厚度显著增加[13]。此外，有研究者通过免疫组织化学研究发现，OVX组较假手术组和EGCG注射组的脑信号蛋白 4D（semaphorin 4D，Sema4D）表达阳性面积百分比更高，表明EGCG抑制Sema4D在骨组织中的表达[14]。Shen等[15]将OVX大鼠口服GTE的骨保护研究成果转化为一项6个月的安慰剂对照随机临床试验，在GTE补充组中，1个月后观察到较高的骨特异性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase，BAP）值——即骨形成增加，同时显示绝经后骨质疏松妇女的静态腿部肌肉力量/耐力显著提高。另一项研究发现股骨头缺损处的局部EGCG可通过增加骨量来增强新生骨的形成，从而改善力学性能，包括最大载荷、断裂点、刚度和极限应力，即局部EGCG可用于骨缺损的治疗[16]。

1.2 茶多酚对成骨细胞的影响

目前的研究结果显示，EGCG作用于成骨细胞主要有两个方面。其一是影响成骨细胞的骨保护素含量，EGCG能增强成骨细胞中前列腺素F2α（PGF2α）和前列腺素E2（PGE2）刺激的骨保护素（osteoprotegerin,OPG），通过激活成骨细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和应激激活蛋白激酶/c-Jun N末端激酶（SAPK/JNK）来刺激骨保护素合成[17-18]，Fujita等[19]发现EGCG可显著增强成骨细胞样MC3T3-E1细胞中骨形态发生蛋白-4（bone morphogenetic protein，BMP-4） 刺激的 OPG释放，且其刺激作用是在转录水平介导；其二是影响成骨细胞的迁移速率，Kawabata等[20]研究发现EGCG可显著降低人胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor，IGF-1） 诱导的 p44/p42 MAPK 的磷酸化，抑制成骨细胞迁移。同期研究发现，EGCG通过抑制由表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）触发的p38MAPK时活化而抑制成骨细胞迁移，EGCG的抑制作用是剂量依赖性，其在浓度为3 μmol/L时达到最大抑制作用[21]。

另外，EGCG还可通过抑制成骨细胞样MC3T3-E1细胞中的P70 S6激酶来增强肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）刺激的白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的合成和释放[22]。

1.3 茶多酚对破骨细胞的影响

茶多酚可以抑制破骨细胞分化，诱导破骨细胞凋亡，也能降低破骨细胞的活性。近年来茶多酚对破骨细胞的研究热点主要还集中在EGCG对破骨细胞分化、生长和功能的标志物上。

RANKL能诱导巨噬细胞分化成成熟的破骨细胞，将绿茶提取物和RANKL同时添加到RAW264.7小鼠巨噬细胞中，与只添加RANKL组相比，其破骨细胞的数量减少、骨吸收减少和更少的肌动蛋白环；进一步检测破骨细胞特异性基因表达情况，表明绿茶提取物组的组织蛋白酶K、酒石酸抗性酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRACP）和MMP-9的表达均下调[23]。将ECGC添加到成熟大鼠破骨前体细胞和成熟破骨细胞的培养物中，也得到了类似的结论[24]。

Chen等[25]使用RAW 264.7细胞和滋养细胞ST2的共培养来评估EGCG如何调节RANK/RANKL/OPG 途径，在 1、10 μmol/L 浓度下，OPG 的 mRNA表达增加，RANKL的mRNA和蛋白水平均降低，且TRAP活性降低。表明EGCG可通过基质细胞调节RANKL/OPG比率来影响破骨细胞的生成。Tominari等[26]通过体内实验和体外实验均验证EGCG明显抑制脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导的骨吸收，体内实验通过将LPS注射到小鼠下颌骨的牙龈中，LPS显著降低了下颌牙槽骨的BMD，而同时注射EGCG可显著抑制LPS诱导的小鼠BMD损失。体外实验表明EGCG可通过抑制成骨细胞中RANKL的表达和成骨细胞中PGE的生物合成来抑制破骨细胞骨的吸收。

2 茶多酚在组织工程中的应用

2.1 茶多酚对骨髓间充质干细胞分化成骨细胞的影响

骨髓间充质干细胞具有自我更新和分化成骨细胞的能力，茶多酚作用于骨髓间充质干细胞，影响其成骨分化的研究已引起越来越多的关注。

有研究显示，EGCG是以剂量依赖形式增强人骨髓源性间充质干细胞（human bone marrow derived MSCs，hBMSCs）的成骨分化，特别是在浓度为5 μmol/L的情况下对其成骨谱系发展具有很强的刺激作用，表现为碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性增加，成骨基因表达上调以及骨样结节形成[27-28]。另一项研究发现，EGCG可抵消H2O2诱导的对hBMSCs成骨分化的不利影响，经EGCG处理后，β-连环蛋白（β-catenin）和细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）的表达上调，提示Wnt通路可能参与了EGCG对hBMSCs成骨分化的影响[29]。最近的一项研究报道EGCG可上调mir-210，并通过作用mir-210靶向的efna3基因显著抑制缺氧诱导的骨髓间充质干细胞凋亡，且EGCG治疗组还在常氧或缺氧条件下促进MSCs中的“成骨标志物”的表达[30]。Lin等[31]报道，EGCG不仅促进hBMSC的成骨分化还可促进其矿化，空气结合的EGCG与新鲜的EGCG相比，其hBMSC培养物矿化水平并没有改变，表明EGCG抗氧化活性的丧失仍可增强细胞培养物矿化。Liu等[32]研究显示只有低剂量的EGCG通过抑制由α肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNFα）刺激的 NF-κB信号传导，增强间充质干细胞的细胞活力和成骨细胞分化，并且能够逆转TNFα诱导的抑制。

另外，一项研究已确定EGCG和机械刺激在人骨髓间充质干细胞（hMSC）的成骨分化中具有协同作用，当同时施加EGCG和3%拉伸时，Runt相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）表达显著增加、心肌素表达显着降低、成骨标志物表达增加，同时线粒体的生物发生和抗氧化能力增加。此研究不仅通过测量相关的标志物更详细地确认EGCG在成骨分化中的作用，还验证了EGCG在由机械牵拉诱导的成骨分化中具有协同作用[33]。

在类似的研究中，Kaida等[34]将去分化脂肪（DFAT）细胞在含有和不含100 nmol/L浓度地塞米松（Dex）的成骨培养基（OM）中培养，分别给予10 μmol/L EGCG处理。结果显示，补充EGCG可诱导去分化脂肪细胞的增殖、早期成骨分化和矿化。与OM（Dex）+EGCG相比，OM+EGCG可诱导早期成骨分化和更高的矿化水平。

2.2 茶多酚在骨组织工程中的应用

茶多酚作为骨生物材料表面修饰分子，能诱导和刺激成骨细胞成骨、矿化，而不需要其他骨诱导因子的高成本，因此在骨组织工程应用中十分重要。

EGCG和猪皮明胶通过脱水缩合剂制备海绵状的交联物，将明胶和EGCG/明胶植入临界尺寸的小鼠颅盖缺损中，发现EGCG/明胶复合物具有骨传导的潜能；EGCG/明胶和小鼠间充质干细胞系（D1细胞）共培养表明EGCG/明胶可诱导D1细胞的成骨细胞生成，这种EGCG/明胶实际上是一种功能化的茶多酚控释系统，能更有效地促进骨形成[35]；随后该团队发现真空加热的EGCG改良明胶具有更好的骨形成能力、更高的机械强度和更低的可降解性[36]。类似的研究发现EGCG修饰可改变明胶物理化学性质，这种改变可能为多能祖细胞提供优选的微环境，在体内更易于骨形成[37]。此外，EGCG修饰的胶原膜可以募集巨噬细胞，下调促炎因子的分泌，促进再生免疫反应控制软组织和骨再生[38]。

茶多酚修饰其他骨生物材料也被广泛研究，多孔磷酸钙陶瓷（PCPC）表面的Ca2+对TP分子进行吸附和固定，这些TP分子调节了PCPC表面上磷酸钙纳米棒组件的成核和结晶，改变其表面微环境，使PCPC/TP可有效促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和成骨分化[39]。在钛合金表面“镀”一层茶多酚，从而具备一定生化功能；并在表面培养间充质干细胞发现，这种茶多酚功能化表面的钛合金可明显促进其矿化并表达较高的骨钙蛋白[40]。将茶多酚还原氧化石墨烯（TPG）通过电化学沉积在钛（Ti）基底上，发现Ti-TPG比Ti具有更好的生物相容性，可促进细胞增殖和黏附，且无毒性；此外，Ti-TPG还可促进骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP-4、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和 ALP 的表达[41]。

3 结语与展望

综上所述，笔者总结了茶多酚对骨组织及相关细胞的作用，它们不仅在预防和治疗骨质疏松中起重要作用，而且还在骨生物材料中起到促进骨形成作用。经EGCG修饰的肽合金、明胶海绵、多孔磷酸钙等骨组织再生材料，可明显提高骨形成能力和抗降解能力，这些作用是由多酚对成骨细胞的刺激作用及其对氧化应激和炎性细胞因子的保护作用引起的，从而为骨折患者骨组织工程的新应用铺平了道路。

未来的研究有必要精确地确定最佳剂量的茶摄入量或三磷酸鸟苷（GTP）补充剂，并检查茶多酚与骨骼健康必需的其他营养素（包括钙和维生素D）之间的潜在相互作用，并且应该有足够的持续时间来评估BMD的变化以及骨转换的生物标志物，从而可进行具有生理学结果的药效学研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突