H9C2大鼠胚胎心肌细胞缺氧/复氧损伤对端粒酶逆转录酶的表达变化

郭海, 马海平, 张永强, 王江

(新疆医科大学第一附属医院麻醉科, 新疆 乌鲁木齐 830054)

随着社会的发展, 老年冠心病患者逐年增多, 对于此类患者心肌细胞缺氧/复氧损伤是影响其寿命的主要原因, 目前心肌保护的研究热点在于细胞衰老和再生复制的内在机制[1-2]。 在心肌细胞自我修复的过程中, 端粒酶逆转录酶(telomerase reverse trameripmse, TERT)扮演着重要的角色, 有研究[3-4]报道心肌缺氧复氧损伤时TERT被诱导表达发挥心肌保护作用。 但在不同的缺氧时间下, TERT具体的表达情况尚未见报道。 本研究对H9C2心肌细胞株实施不同时间缺氧复氧损伤, 观察不同缺血情况下心肌组织端粒酶的表达情况, 进而探究TERT对缺血心肌的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

H9C2大鼠胚胎心肌细胞株购自凯基生物; CO2细胞培养箱(Smart Cell HF-90)购自上海力康仪器有限公司; DHG型荧光倒置显微镜(Eclipse TS100-F)购自日本尼康公司; 胎牛血清(FBS)购自美国Life technologies公司; 磷酸盐缓冲液粉剂(PBS)(ZLI-9062)购自北京中杉金桥生物公司; DMEM(高糖)培养(C11965500BT)、 青霉素-链霉素双抗(10 000 U, SC30010)、 0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA, 25200-056)均购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 缺氧损伤模型[5]先将低氧混合气体(94% N2和5% CO2, 1%O2)预充缺氧缓冲液30 min[磷酸氢钠(NaH2PO4) 0.9 mmol/L, 氯化钾(KCl) 10.0 mmol/L, NaHCO36.0 mmol/L, 氯化钠(NaCl) 98.5 mmol/L, 氯化钙(CaCl2) 1.8 mmol/L, 硫酸镁(MgSO4) 1.2 mmol/L, HEPES 20 mmol/L], pH 6.8, 将培养瓶中培养液替换成为氧缓冲液, 培养皿放置在充入低氧混合气体的环境中培养。

1.2.2 缺氧复氧方案[5]缺氧复氧时间, 本研究参照前期研究结果, 选取最佳复氧时间, 具体如下, 将缺氧损伤后的细胞更换正常培养液, 于37 ℃、 5% CO2常氧培养箱中继续培养3 h。

1.2.3 实验分组及处理 (1)正常对照组: 正常进行培养; (2)缺氧3 h组: 缺氧3 h, 后进行复氧3 h; (3)缺氧6 h组: 缺氧6 h, 后进行复氧3 h; (4)缺氧12 h组: 缺氧12 h, 后进行复氧3 h。 每组分为10个培养皿次。

1.2.4 CCK-8法测定细胞活力 缺氧/复氧处理后, 收集细胞上清液检测乳酸脱氢酶(LDH)含量。 贴壁细胞加入10% CCK-8溶液, 在37 ℃恒温培养箱中培养, 1～4 h后450 nm波长下测定光密度。 设置试剂背景孔, 每组5个重复。

1.2.5 测定细胞上清液中LDH的含量 缺氧/复氧处理后, 收集96孔板各孔的细胞上清液于一个新的96孔板中, 各孔加入60 μL LDH检测工作液, 用锡箔纸包裹后置于摇床上, 室温孵育30 min。 在490 nm处测定吸光度(A)值。 选取≥600 nm的某一波长作为参考波长, 进行双波长测定。

1.2.6 Western blot检测细胞总蛋白中TERT的表达量 取对数生长期H9C2细胞, 37 ℃、 5% CO2培养24 h 贴壁后, 培养瓶(25 cm2)中细胞贴壁融合达80%时, 弃掉上清液, PBS洗涤贴壁细胞2次, 用完全培养液制备成0.2×104～1×104cells/mL单细胞悬液, 后续按照Western blot实验标准操作。

2 结果

2.1 各组H9C2细胞活力的变化

缺氧处理3、 6和12 h后, 与对照组相比, 细胞株的存活率明显下降(P<0.05, 表1), 说明本研究缺血再灌注模型的建立符合实验要求。

组别存活率/%处理3 h处理6 h处理12 h正常对照组99.71±4.57102.17±2.0199.69±2.08H/R处理组85.32±3.09a071.99±3.06a44.90±1.89a

aP<0.05vs正常对照组.

2.2 各组H9C2细胞LDH含量的变化

缺氧处理3、 6和12 h后, 与对照组相比, 细胞株的LDH含量明显升高(P<0.05, 表2)。

组别LDH含量(A值)处理3 h处理6 h处理12 h正常对照组0.39±0.030.43±0.010.57±0.03H/R处理组0.61±0.04a0.69±0.06a1.31±0.06a

aP<0.05vs正常对照组.

2.3 各组细胞TERT蛋白的相对表达量的变化

缺氧处理3、 6和12 h后, 与对照组相比, 各时点细胞株的TERT蛋白含量明显增高。 其中在缺氧6 h TERT蛋白含量最高(P<0.05, 表3, 图1)。

组别TERT蛋白处理3 h处理6 h处理12 h正常对照组0.15±0.030.13±0.020.17±0.02H/R处理组0.21±0.04a0.49±0.05ac0.26±0.02a

aP<0.05vs正常对照组;cP<0.05vs处理3、 12 h.

图1 Western blot检测TERT蛋白的表达

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是老年患者围术期最为常见的心脏不良事件, 其内在机制被发现与钙超载、 炎性反应及氧自由基产生等多个因素相关, 而心肌缺血再灌注损伤最终结果则会引起心肌细胞凋亡[6-8]。 真核细胞生物的染色体末端存在端粒这一特殊结构, 端粒会在细胞分裂过程中持续缩短, 而在端粒中存在特殊DNA序列, 可以防止染色体被降解, 因此, 端粒可以很好保护细胞染色体, 进而抑制细胞凋亡, 而端粒结构及长度的稳定则有赖于端粒酶[9-10]。 因此, 提升和改善端粒的功能有助于缺血再灌注损伤的恢复, 而提升端粒的功能, 则有赖于端粒酶活性的提升, 端粒酶的活性主要取决于TERT, 此外, TERT可以提高DNA修复蛋白的表达进而修复DNA, 稳定染色体结构, 并且可以促进调节细胞增殖而抑制细胞凋亡[11-12]。

本研究采用了前期本课题组建立的心肌细胞缺氧复氧模型, 分别实施了3、 6、 12 h的缺氧并进行了3 h的复氧, 与对照组相比, 心肌细胞株的存活率随着缺氧的时间延长明显下降。 说明本研究缺血再灌注模型的建立达到了实验要求。 本研究发现, 缺氧处理3、 6和12 h后, 与对照组相比, 细胞株的LDH含量明显升高。 当心肌细胞受损后细胞内的LDH会渗透到细胞外液, 因此, 可以直接通过培养液中LDH的含量评价心肌细胞的受损情况。 有研究结果表明, 缺血心肌细胞在灌流恢复时, 血液中高含量氧分子进入心肌细胞, 从而引发大量过氧化氢、 超氧阴离子等的产生[13-15]。 这些因子均能损伤细胞膜, 最终导致心肌细胞损伤LDH渗漏[16-17]。 染色体DNA随着细胞增殖而不断复制, 在这一过程中, 端粒会不断缩短。 端粒酶可以利用自身RNA通过TERT逆转录过程不断合成端粒DNA, 从而使不断缩短的端粒得到延长, 防止因端粒缩短及消失而引发的细胞凋亡。 TERT决定了端粒酶的表达水平, 因此, TERT具有抑制细胞凋亡的功能, 同时TERT 还能抑制因大量营养因子减少引起的细胞凋亡[18-19]。

本研究中设置不同缺氧时间, 发现经过缺氧处理, 与对照组相比, 各时点细胞株的TERT蛋白含量明显增高。 其中在缺氧6 h TERT蛋白含量最高。 本研究认为, 当缺氧发生早期(3～6 h)心肌细胞端粒受损, 端粒损伤后能够激活内源性的修复机体, 从而激活TERT的表达起到修复作用, 但随着缺氧时间延长, 心肌细胞损伤严重, TERT的表达也随之下降。 本研究中探讨了不同缺氧损伤时间对TERT的作用情况, 其具体作用机制尚待进一步研究。