不同PDA对几种霉菌的生长、产孢子量及胞外酶活力的影响*

林先锋 陈思达 张兴明 林丽萍 张凤英**

（1 江西农业大学食品科学与工程学院 江西南昌 330045 2 江西省食品检验检测研究院 江西南昌 330045）

土豆块茎中约含淀粉15～25%，蛋白质2～3%，脂肪0.7%，粗纤维0.15%，还含有丰富的钙、磷、铁、钾等矿物质，以及VC、VA 和B 族维生素，营养丰富［1-2］。土豆葡萄糖琼脂培养基（简称PDA）是一种以土豆为主要原料的半合成培养基,常用于真菌的培养［3］。由于现配PDA 需经过购买土豆、洗净、切片和煮制等较繁琐的过程，相关企业开发了商品化速成PDA 培养基，只需称量加水融化即可，简单方便快捷。但在使用PDA 进行传代、活化和转接培养菌种的过程中,发现用当季和过季土豆制备的PDA 培养青霉、黑曲霉和根霉等常见霉菌菌株时，它们的长势有明显差别，现配PDA 与商品化速成PDA 的效果也有所不同。例如，在使用商品化速成PDA 培养桔青霉时，发现不仅菌丝生长缓慢,而且培养4～5 d 都不长孢子或孢子很少；用于转接曲霉、根霉菌体生长状况也不理想。鉴于目前未见任何有关现配PDA 与商品化速成PDA 应用效果方面的报道，本文对几种霉菌在现配PDA 与商品化速成PDA 上的生长、产孢子量及胞外酶活力进行了比较研究。

本文以米根霉2-2、黑曲霉柚-1 和酒精酵母Sa2 为实验菌株,通过比较各菌株分别在当季土豆现配PDA、过季土豆现配PDA 和商品化速成PDA 上的生长情况、胞外酶活力及应用效果，确定商品化速成PDA 的应用范围和应用价值。以期为从事相关研究的科研工作者在选择PDA 培养基时提供参考,针对所培养菌株的用途选择配制方法简便有效的PDA 培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 黑曲霉柚-1（Aspergillus niger）、米根霉2-2（Rhizopus oryzae）和酿酒酵母Sa2（Saccharomyces cerevisiae），均由江西农业大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。

1.1.2 原料 市售当季土豆、过季土豆、豆芽及糯米；福建平和琯溪蜜柚皮，购自江西农业大学校园水果店。

1.1.3 药品及主要仪器 商品化速成PDA 培养基粉（南昌医药公司），分析纯无水葡萄糖、冰醋酸及醋酸钠，生物试剂DNS 溶液，食品级羧甲基纤维素（CMC），定性滤纸。

SPX-450 智能生化培养箱（上海谷宁仪器有限公司），GZX-DH 电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂），DSX-280 手提式压力灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 当季PDA 培养基（APDA）：称取200 g 当季土豆，洗净去皮切成小块，加水1 000 mL 煮沸，20 min；纱布过滤，滤液加水补足1 000 mL，再加入20 g 葡萄糖及20 g 琼脂，加热使其充分溶解；分装，121℃灭菌20 min。

过季PDA 培养基（BPDA）：称取200 g 过季土豆，洗净去皮切成小块，其余操作同APDA。

商品化速成PDA 培养基（CPDA）：称取商品PDA 粉46.0 g，加入1 000 mL 蒸馏水，115℃高压灭菌20 min。

液体APDA：同固体APDA，不加琼脂。

液体BPDA：同固体BPDA，不加琼脂。

豆芽汁培养基：称取200 g 新鲜豆芽，洗净，切碎，加水1 000 mL，煮沸20 min；纱布过滤，滤液加水补足1 000 mL，再加入200 g 葡萄糖，加热使其充分溶解，分装三角瓶，121℃灭菌20 min。

1.2.2 3 种PDA 对几种霉菌形态的影响 用接种环分别挑取3～5 环黑曲霉或米根霉斜面菌体接入5 mL 无菌水中，振荡摇匀，制成孢子悬液。分别取几微升孢子悬液点接在各PDA 平板中间，30℃恒温培养24～72 h，观察霉菌的菌丝直径、孢子穗或孢子囊大小、菌落直径和菌落形态等［4］。

1.2.3 酵母菌在当季和过季液体PDA 的生长情况 用接种环挑取3～5 环斜面酵母菌接入5 mL无菌水中，振荡摇匀，制成菌悬液。用无菌移液管分别吸取1 mL 酵母菌悬液至100 mL 当季液体PDA 和过季液体PDA 中,每组3 个平行，30℃恒温培养16 h，检测酵母菌大小和数量。

1.2.4 酵母菌对乙醇发酵的影响 用无菌移液管分别吸取5 mL 2 种液体PDA 酵母菌培养液至100 mL 豆芽汁培养基中，摇匀，30℃恒温培养4～5 d，直至豆芽汁培养液中的气泡消失，用蒸馏法测定发酵液的酒度。

1.2.5 黑曲霉分解柚子皮能力粗测［5］挑取3 种PDA 斜面培养的黑曲霉接入3 mL 无菌水中，振荡摇匀，制成孢子悬液备用。称取10 g 新鲜柚子皮，切块，放入培养皿中，接入适量黑曲霉孢子悬液，30℃恒温培养4～6 d，将长满黑孢子的柚子皮取出，用清水将表面的菌体及分解物冲洗干净，放入56～60℃烘箱内烘干至恒重后称重（记为M）。同时，将10 g 新鲜柚子皮（不接种孢子悬液）放入烘箱内干燥至恒重（记为M0）。计算黑曲霉对柚子皮的分解率（%）=×100%。再用光学显微镜观察柚子皮分解前、后的显微结构。

1.2.6 米根霉PDA 斜面培养物的糖化力测定［6］挑取3 种PDA 斜面培养的米根霉菌体放入5 mL 无菌水中，振荡摇匀，制成孢子悬液备用。称取糯米100 g 用纱布包好,浸泡4 h 左右放入锅中隔水蒸至米粒透明无白心。待糯米蒸熟冷却后，放入杯中。将上述孢子悬液均匀淋入糯米饭中，再加入55 mL 纯净水，保鲜膜封口，30℃恒温发酵1.5～2 d，测发酵液的糖化力和液化力，根霉的糖化力用发酵液的糖度表示,液化力用压榨出发酵液的体积数表示；同时品尝发酵液的口味。

1.2.7 发酵液的糖度测量 用手持式糖度计测定发酵液的糖度。

1.2.8 米根霉胞外糖化酶活力的测定 用斐林滴定法［7］测定米根霉胞外糖化酶的活力。

1.2.9 纤维素酶系活力测定

1.2.9.1 粗酶液的制备 在500 mL 锥形瓶中装入24 g 柚子皮粉、1 g 麸皮和1 g 硫酸铵,用玻璃棒搅拌均匀，灭菌冷却后加入16 mL 无菌水，摇匀打散，28℃恒温培养60 h（培养期间摇晃4～5 次）。取适量发酵固体于锥形瓶中,加入50 倍蒸馏水，适当搅拌后在40℃恒温水浴锅中浸提1 h。用滤纸过滤，滤液即为粗酶液。

1.2.9.2 3，5-二硝基水杨酸测定还原糖法检测滤纸酶活和CMC 酶活 以CMC-Na 或滤纸为底物，加入1 mL 稀释粗酶液和l mL pH=7.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液于50℃水浴锅中，保温65 min，加入2 mL DNS 试剂停止反应，再沸水浴煮沸10 min；冷却后，于530 nm 处比色检测CMC 酶活和 滤纸酶 活［8］。

2 结果与分析

2.1 霉菌和酒精酵母在不同PDA 上的生长状况

2.1.1 黑曲霉生长状况 不同时间内，黑曲霉在3 种PDA 上的培养情况见表1。由表1可知，培养24 h 和48 h 时,黑曲霉在2 种现配PDA 上的菌落直径比CPDA 更大，菌落蔓延范围更广，菌丝生长速度更快。培养72 h 时，APDA 的菌落直径最大，CPDA 次之，BPDA 最小。

表1 不同时间黑曲霉的培养状况

此外,培养48 h 后,APDA 上黑曲霉的孢子穗最大,达到了68.12 μm，菌丝稠密粗壮,达16.20 μm，产大量黑孢子，非常适合黑曲霉的生长。而BPDA和CPDA 上黑曲霉的孢子穗大小和菌丝粗细相差不大，都不及APDA 培养的效果理想。黑曲霉72 h培养效果见图1（上）（本文附图见封四）。由图1很容易看出，72 h 后，2 种现配PDA 的培养效果比CPDA 更好，表现为菌丝浓密，产大量黑孢子；而CPDA 上黑孢子明显更少，菌落小，菌丛低矮，边缘有较大一圈白色菌丝，生长相对更为缓慢。

总体上看，黑曲霉在2 种现配PDA 上生长更旺盛，长速更快。

2.1.2 米根霉生长情况 米根霉在3 种PDA 的生长情况见表2。由表2可知，米根霉在2 种现配PDA 培养24 h 后菌落直径较大、长势较快，而在CPDA 上长势较慢、菌落直径较小；在APDA 上的菌丝稠密粗壮,有光泽,而在CPDA 上菌丝细小无光。

表2 米根霉的生长情况

培养48 h 后,米根霉均长满平皿；在APDA上长势最好，表现为：菌丝稠密粗壮，有光泽，产大量黑孢子，孢子囊较大。而在CPDA 上米根霉菌丝细小无光，黑孢子较少。其培养48 h 后效果见图1（下）。以上结果说明，2 种现配PDA 对米根霉的生长繁殖更有利。

2.1.3 酵母菌在2 种液体PDA 的生长情况 就数量而言，酵母菌在液体BPDA 中培养16 h 后比液体APDA 中多，为6.16×107个／mL，而后者仅为4.62×107个／mL；从大小上看，液体APDA 中的酵母菌为5.73×8.80 μm，更接近球形，而液体BPDA中的酵母菌为5.27×9.07 μm,更接近长椭圆形，即液体APDA 培养的酵母菌粗壮一点,液体BPDA培养的酵母菌细长一点。从酵母数量上看,液体BPDA 比APDA 多1.46×107个／mL。

2.2 不同PDA 培养的霉菌和酵母的应用效果

2.2.1 黑曲霉分解柚子皮能力的粗测 图2（上）为黑曲霉在柚子皮上生长6 d 的效果。很明显，APDA 组柚子皮上布满黑孢子，BPDA 组柚子皮上基本布满黑孢子,而CPDA 组柚子皮上仅一半区域长有黑孢子，说明2 种现配PDA 上的黑曲霉对柚子皮的利用率更高。

由表3可知，用2 种现配PDA 培养的黑曲霉对柚子皮的分解率分别为60.77%和54.70%，均比用CPDA 培养的黑曲霉对柚子皮的分解率更高,说明2 种现配PDA 更适合黑曲霉生长繁殖，产纤维素酶的活性更强。用APDA 培养的黑曲霉分解能力最强，对柚子皮的利用率最高，比BPDA高6.07%，比CPDA 高6.63%。

表3 黑曲霉分解柚子皮能力

柚子皮被3 种PDA 培养的黑曲霉分解前、后的显微结构见图2（下）。显而易见，原本致密的纤维结构被不同PDA 培育的黑曲霉分解后的松散程度明显不一样,其中由现配PDA 培养的黑曲霉分解后的柚子皮纤维结构的松散程度比CPDA 更高，这说明2 种现配PDA 培养的黑曲霉产纤维素酶活力更高，分解柚子皮纤维素能力更强，应用效果更好。

2.2.2 3 种PDA 培养米根霉的应用效果 PDA米根霉斜面培养物发酵糯米的糖化力和液化力见表4。由表4可知，用2 种现配PDA 培养的米根霉的糖化力和液化力,均比用CPDA 培养的米根霉的糖化力和液化力更高，说明现配PDA 更有利于米根霉分泌糖化酶，且其酶活力更高。就2 种现配PDA 来说，用APDA 培养的米根霉的液化力比用BPDA 培养的米根霉的液化力更高。

表4 米根霉和黑曲霉的胞外酶活

2.2.3 酵母菌对乙醇发酵的影响 从发酵液酒度分析,液体APDA 培养的酵母菌发酵的酒度为11.13 度，而用液体BPDA 培养的酵母菌发酵的酒度为10.73 度，前者比后者提高了3.73%。

总体分析,虽然酵母菌在液体BPDA 中培养16 h 后的数量更多,但其酒化酶活性不如APDA中培养的酵母菌，发酵能力较差。酵母数量多少与初始接入的酵母种细胞数量有一定关系；说明酒化酶活性与所培养的酵母的发酵能力关系较大，与酵母细胞数量关系较小。综上可知，液体APDA培养的酵母菌的酒化酶活性较强。由此可见营养对酒精酵母发酵能力的重要性。

2.3 不同PDA 培养霉菌的胞外酶活力

2.3.1 米根霉胞外糖化酶活力 以米根霉孢子的麸皮培养物作为酒曲，检测不同PDA 培养米根霉的胞外糖化酶活力，结果见表4。由表4可知，3 种PDA 培养的米根霉的胞外糖化酶活力大小排列次序为：APDA＞BPDA＞CPDA,与上面用于糖化糯米的结果一致。

2.3.2 黑曲霉的胞外纤维素酶活力 不同PDA培养的黑曲霉的胞外纤维素酶的滤纸酶活力和CMC 酶活力见表4。由表4可知，3 种PDA 培养的黑曲霉的胞外纤维素酶的CMC 酶活力大小排列 次 序 为：APDA ＞BPDA ＞CPDA，APDA 和BPDA的CMC 酶活力比CPDA 高23.2～40.7 U／mL；APDA与BPDA 的滤纸酶活相差不大,但比CPDA 要高8.1～8.7 U／mL。

3 结论与讨论

用土豆现煮现配的PDA 培养生长的黑曲霉菌丝浓密粗壮，黑孢子多，生长速度快；在商品化速成PDA 上菌落小，菌丛低矮，黑孢子少，生长较缓慢。现配PDA 培养的黑曲霉产胞外纤维素酶活力更高,现配PDA 的CMC 酶活比商品化速成PDA 高23.2～40.7 U／mL，滤纸酶活高8.1～8.7 U／mL，分解柚子皮纤维素能力更强，应用效果更好。

米根霉在当季土豆现配PDA 上长势良好：菌丝稠密粗壮，有光泽，黑孢子多，孢子囊也较大。在商品化速成PDA 上生长速度不仅慢,而且菌丝纤细无光，黑孢子也更少、更小。2 种现配PDA 培养的米根霉产胞外糖化酶性能较好，且酶活更高。对于根霉菌来说，2 种现配PDA 应用效果也更好。

用当季液体PDA 培养的酒精酵母分泌的酒化酶活性更好，酒精发酵能力更强。

综上所述：现配PDA 培养的根霉、黑曲霉和酒精酵母生产应用性能明显比商品化速成PDA 更优越。当季土豆现配PDA 由于营养成分丰富，非常适合霉菌的生长繁殖，有助于其产酶性能及生产应用效果的稳定；商品化速成PDA 虽然配制简便快捷，但只适合做一般验证实验和生理生化实验，不适合生产用菌株的活化、转接培养。如果要应用于生产，必须选用当季土豆现配的PDA。

为何过季土豆PDA 和商品化速成PDA 培养的微生物长势弱，应用效果差？深究其原因应该是二者营养价值比当季土豆要差,因为许多营养成分有半衰期，例如，磷的半衰期为14 d、铁的半衰期为90 d，还有一些生长素例如VC 遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是氧化酶及铜、铁等金属离子存在时，可促进其氧化破坏。导致土豆在储存过程中,有些营养成分含量会降低；商品化速成PDA 粉不仅存在营养成分衰变的问题，还有在加工过程中需要高温喷雾干燥或高温烘干工艺，有些营养物质会受到一定程度的破坏；此外商品化速成PDA 粉在保质期内的某些营养成分也可能会随着时间的延长而流失；所以导致用其培养的微生物生长缓慢、应用性能减弱。

由于受季节限制,微生物科研工作者无法一年四季都能获得当季新鲜土豆。为保证有效的菌株转接培养活化应用科研工作的顺利进行,建议将当季新鲜土豆按每400 g 加1 L 水煮成双料土豆汁，置于冰箱中冷冻。用时取出所需量融化，加一倍水，再按比例添加葡萄糖和琼脂即可，使用效果与现配当季PDA 相当。