探究早期兔膝骨关节炎中ERK信号通路对细胞自噬的作用

师婕，张钰，许秀峰，胡丽芳，赵巧珍，陈琛，黄丹，李锦，陈焕，陈立早

骨关节炎(Osteroarthritis,OA)是一类好发于中老年人的慢性退行性骨关节病变[1-3]。在多种物理及生化因素的刺激下，金属蛋白酶、II型胶原和蛋白聚糖等细胞外基质的渗出增多，引起软骨结构的退变，由此诱发骨关节炎的典型表现[4-6]。中晚期骨关节炎的病理过程不可逆，因此目前研究者专注探索早期骨关节炎的治疗方法[7]。近年来，细胞自噬被认为能抑制骨关节炎中某些蛋白的形成，如金属蛋白酶3(Metalloproteinase-3，MMP-3)、活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)、白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)等，因此在骨关节炎以及其他年龄相关的疾病中，细胞自噬的激活减弱可能为其重要因素之一[8-12]，这启发了研究者们靶向调节细胞自噬很可能成为一种新型治疗骨关节炎的方法。UNC-51样激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1),Beclin1和微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3,LC3)是细胞自噬中的关键蛋白，其中我们认为ULK1是启动者，Beclin1是调控者,LC3是执行者。

研究发现，细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)信号转导通路对细胞自噬具有调控作用[13-16]，但小鼠睾丸支持细胞系中，致癌物质林丹介导的ERK信号通路却抑制了自噬的发生。因此，不同疾病中ERK信号通路对细胞自噬的作用不一致。本研究首次探索骨关节炎中ERK信号通路对细胞自噬的作用，并进一步明确ERK信号通路的作用机制。本研究方案采用ERK信号通路抑制剂U0126行双膝关节腔注射的方式，以兔为研究对象，探索ERK途径在骨关节炎中对MMP3和细胞自噬的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取24只4个月龄的健康新西兰雄性大白兔为研究对象，平均体重2kg左右，随机分为3组，对照组、OA组和OA+U0126组，每组8只。

1.2 对照组 不接受任何干预措施；OA组和OA+U0126组予以连续3d双膝关节腔注射0.1ml 4%的木瓜蛋白酶造模；OA组于造模后15d处死；OA+U0126组：造模7d后；予以0.1ml 100umol/ml的ERK抑制剂U0126连续3d双膝关节腔注射，于造模后15d处死。

1.3 评定标准 ①大体观察:观察实验前后每组兔子毛色的光泽度及体重变化，造模处局部有无红肿发热及坏死，每组兔子自由活动情况和生命体征等。切取双膝股骨内侧髁进行肉眼观察：关节软骨色泽是否暗淡，表面是否光滑，有无增厚、坏死及粘连；滑膜有无增生、粘连；关节液的色泽、量；关节腔内有无粘连等变化。②组织学观察：取每组实验兔双侧股骨内侧髁关节面软骨为实验标本，给予4%多聚甲醛固定并至脱钙完全。随后行常规石蜡包埋和连续病理切片，分别进行苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin Staining，HE)染色、甲苯胺蓝及番红-固绿染色，光镜下观察软骨的形态变化、细胞簇集及排列是否整齐、基质染色及软骨表面裂隙及纤维化等情况。通过甲苯胺蓝染色半定量分析糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)。采用双盲法按国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 软骨病理变化评分标准[17]。OARSI评分根据HE和番红-固绿染色，计算分期(0～4期)*分级(0～5级)的总分来评价OA严重程度。且OARSI评分小于12分被定义为骨关节炎早期；OARSI分级为1级时，关节软骨即有早期退变。OARSI评分的分数越高，则说明骨关节炎病变越严重。③蛋白免疫印迹：按蛋白免疫印迹法测定样品中的蛋白浓度，经电泳、转膜、封闭、一抗、二抗敷育以及ECL显色曝光后，通过图像分析软件IPP6进行灰度分析检测空白对照组、OA组和OA+U0126组中MMP3、磷酸化的ERK(P-ERK)、ULK1、自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/LC3I的灰度值。

2 结果

2.1 大体观察 3组兔子实验前后的体重以及体重的变化各组两两比较差异无统计学意义，见表1。对照组软骨表面光滑较薄，色泽明亮，未见裂隙，触之较硬；关节滑膜未见增生和水肿等；关节液无渗出。OA+U0126组与对照组比较，软骨色泽稍暗，膝关节软骨表面稍增厚，关节内滑液明显增多。OA组软骨增厚变粗糙最明显，滑液最多。

表1 3组兔子的体重比较

2.2 关节软骨光镜下观察 OA组明显可见软骨表面增厚出现裂隙，软骨细胞增生，细胞基质失染以及细胞排列紊乱和簇集等典型骨关节炎改变。OA+U0126组软骨增厚、细胞增生排列紊乱等改变比OA组轻。见图1，2，3。实验后，OA+U0126组和OA组GAG含量均低于对照组(均P<0.05)；OA+U0126与OA组比较，GAG含量升高(P<0.01)。OA+U0126组和OA组OARSI评分均明显高于对照组(均P<0.05)；OA+U0126组与OA组比较，OARSI评分降低(P<0.01)。见表2。

2.3 蛋白免疫印迹 实验后,OA+U0126组和OA组 P-ERK、MMP3含量较对照组均升高(均P<0.05)，LC3II/LC3I、ULK1和Beclin1含量较对照组均降低(均P<0.05)。OA+U0126组与OA组比较，P-ERK、MMP3含量均降低(均P<0.05)，LC3II/LC3I、ULK1和Beclin1含量均升高(均P<0.05)。见图4和表3。

表2 3组兔实验后GAG含量与OARSI评分比较

与对照组比较，aP<0.05；与OA组比较，bP<0.01

表3 3组蛋白免疫印迹结果比较

与对照组比较，aP<0.05；与OA组比较，bP<0.05

图1 甲苯胺蓝染色 (倍数:10×10)

图2 HE染色(倍数:10×10)

图3 番红-固绿染色(倍数:10×10)

图4 3组蛋白免疫印迹检测结果比较

3 讨论

OARSI评分系统在2016年进一步修改，将分级细化，增加了0.5分、1.5分、2.5分、3.5分及4.5分等区间[18]。根据新版OARSI评分以及我们之前的研究结果, 木瓜蛋白酶造模后15d，软骨OARSI评分接近12分，可作为早期骨关节炎的临界点。因此，本实验设计在木瓜蛋白酶造模15d时将新西兰大白兔处死，取股骨内侧髁软骨标本进行研究。研究结果中，每组OARSI评分均小于12分，证实本实验成功建立了早期骨关节炎模型，而OA+U0126组中OARSI评分较OA组减少，差异具有统计学意义，提示膝关节腔注射ERK抑制剂U0126可部分逆转骨关节炎病理改变。

MMP3作为OA的标记蛋白之一，与软骨细胞的退变密切相关。ERK信号通路激活后发生磷酸化，可参与细胞的增殖分化生长等，当ERK过度激活时，可抑制细胞增殖及凋亡。本研究中，蛋白免疫印迹结果可见，ERK抑制剂U0126经膝关节腔注射后，OA+U0126组中MMP3含量比OA组低；组织学观察发现，OA+U0126组中软骨表面侵犯、软骨细胞退变等病理改变比OA组轻，该结果支持前人对ERK信号通路在骨关节炎中作用的结论，证实了ERK信号通路在早期骨关节炎中对MMP3有调节作用，ERK抑制剂U0126可减少MMP3的形成，减少关节软骨退变，抑制软骨细胞凋亡，从而减缓OA的发展。反向证明了ERK信号通路可加重骨关节炎改变，而且其作用机制与促进MMP3的生成密切相关。

本研究通过ERK抑制剂U0126行兔膝关节腔注射来观察细胞自噬的作用，发现U0126抑制后，自噬相关蛋白Beclin1、ULK1和LC3II/LC3I均明显升高。Beclin1, ULK1和LC3II/LC3I分别于自噬的成核阶段和延长阶段起关键作用。成核阶段，在内质网和高尔基体中，哺乳类动物关键蛋白mTOR通过与ULK1复合物(ULK1、Atg13、Atg101和FIP200组成)相互作用，将细胞外刺激信号整合成自噬特异性信号，然后Beclin1激活与VPS34和VPS15相组合成复合体，通过与多种自噬相关蛋白结合，从而诱导自噬体的形成。延长阶段，LC3前体LC3I被自噬蛋白Atg4B迅速切割，被Atg7激活后，与Atg3和Atg5-Atg12-Atg16复合物连接起来，形成了具有能与自噬体膜相结合能力的LC3II，从而识别细胞器。随后自噬体继续发育成熟，与溶酶体相融，形成自噬溶酶体并最终降解。 本实验结果证明了ERK抑制剂U0126对细胞自噬的激活作用贯穿于整个自噬过程，ULK1的改变提示U0126很可能在细胞自噬的成核阶段即产生了作用，加强了信号传导，激活了更多Beclin1，吞噬了凋亡的软骨细胞器和细胞碎片并最终将其清除。由此，反向证明了ERK信号通路在早期骨关节炎中可抑制细胞自噬作用，从而加重骨关节炎。

本研究通过抑制ERK信号通路，检测细胞自噬3个不同阶段的关键蛋白发现，细胞自噬很可能在成核阶段即受到ERK信号通路的调控作用,可减轻早期OA的病理改变。而本研究为动物实验，可完善体外试验进一步证实研究结论。今后研究将详细探究ERK信号通路对细胞自噬的具体作用机制，以及影响骨关节炎发生发展、影响细胞自噬的其他因素，从而为探索骨关节炎的治疗方案提供新思路。