马来酰亚胺荧光探针及其在硫醇检测中的研究进展

武文聪 Nathaniel S. Finney

摘      要：半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）等生物硫醇分子在维持生命体系的稳定中具有至关重要的作用。因此，对其进行精准快速地检测具有重要意义。马来酰亚胺类荧光探针因具有快速且高选择性的检测生物硫醇分子的性能，已经成为一种检测以上硫醇分子的重要手段，其研究近年来已取得了较大的进展。根据马来酰亚胺类荧光探针设计的多样性，主要对N-取代基马来酰亚胺、双马来酰亚胺和溴代马来酰亚胺类荧光探针的研究现状及在生物硫醇检测中的应用进行了介绍。

关  键  词：马来酰亚胺;生物硫醇;荧光探针;研究进展

中图分类号：TQ 422      文献标识码： A      文章编号： 1671-0460（2020）01-0240-05

Research Progress of Maleimide-based Fluorescent

Probes for Detection of Thiols

WU Wen-cong， Nathaniel S. Finney

（School of Pharmaceutical Science and Technology， Tianjin University， Tianjin 300072， China）

Abstract： Biological thiols including cysteine （Cys）， homocysteine （Hcy） and glutathione （GSH） play a crucial role in maintaining the stability of the living system. Therefore， it is necessary to carry out accurate and rapid detection for biothiols. Because of rapid and highly selective detection characteristics of maleimide-based fluorescent probes， they have been the important method for detecting biothiols， and their research has made great progress in recent years. In this paper， based on the diversity of maleimide-based fluorescent probes， the study status of N-substituted maleimide， bismaleimide and bromomaleimide fluorescent probes was introduced as well as their application in biothiol detection.

Key words： Maleimide; Biological thiols; Fluorescent probes; Research progress

生物硫醇化合物具有獨特的化学反应性，在维持生命体系的稳定中具有至关重要的作用，半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是其代表性分子。其中，Cys具有维持蛋白质结构和功能的作用，Cys缺乏会导致儿童生长缓慢、毛发脱色、肝损伤、肌肉和脂肪损失、皮肤损伤等多种综合征^[1];Hcy与机体生化水平密切相关，体内Hcy浓度异常会导致阿尔茨海默氏症、心血管疾病以及叶酸和维生素B12缺乏等多种疾病;GSH是体内含量最多的生物硫醇小分子，与维持细胞内氧化还原活性、异质代谢、细胞内信号传导和基因调控等功能密切相关^[2]。因此，对生物硫醇进行高灵敏度和高选择性的检测，并探究其在生理病理的生物活性对生化研究及临床诊断具有非常重要的意义。

传统的检测生物硫醇方法包括高效液相色谱、毛细管电泳分离、电化学以及质谱法等，然而这些方法所需成本高、检测时间长、选择性差，很难直接应用于原位检测^[1，3]。在所有硫醇检测方法中，荧光探针基于其操作简单、分辨率高、可选择性、灵敏度高、检测限低以及可细胞内成像等优点^[4]，近年来得到了广泛的发展和应用。

马来酰亚胺在反应速率、选择性和产率方面具有独特的反应性，且对空气、水和热有良好的稳定性，同时，可以直接与多种生物分子中天然存在的硫醇发生反应^[5，6]，现广泛用于生物硫醇的检测。目前，已有超过30种的马来酰亚胺类荧光探针被报道。

1  马来酰亚胺类荧光探针反应原理

基于马来酰亚胺基团的荧光探针多属于“开-关（On-Off）”型探针：其结构通常为荧光团与马来酰亚胺基团共轭连接，见图1，由于该连接会导致荧光淬灭，探针处于“关”荧光状态;在与生物硫醇分子发生迈克尔加成反应后，共轭体系被中断，荧光团的荧光恢复，使探针处于“开”荧光状态^[7]。

马来酰亚胺类探针的荧光淬灭机理包括光诱导电子转移（PET）和分子内电荷转移（ICT）两种，探针与硫醇的反应原理见图1。基于PET机理设计的荧光探针，其荧光团与马来酰亚胺（识别基团）组成一对电子给体和电子受体，在光的激发下荧光团和识别基团之间发生电子转移，使马来酰亚胺基团的最低空轨道（LUMO）或最高占据分子轨道（HOMO）位于荧光团的LUMO和HOMO之间，导致荧光团的激发电子无法回到基态^[5]，发生荧光淬灭;当探针与硫醇分子发生加成反应后，PET效应被抑制，从而恢复荧光。基于ICT机理构建的探针在与被测物反应前后，探针的电子供体或电子受体的给电子或吸电子能力发生改变，导致整个荧光探针的电子分布发生改变，从而影响其吸收光谱的变化^[7，8]。目前报道的马来酰亚胺类荧光探针多是基于PET原理构建得到的。

2  马来酰亚胺类荧光探针

2.1  N-取代马来酰亚胺类荧光探针

2.1.1  N-芳基马来酰亚胺类荧光探针

马来酰亚胺基团直接与荧光团的芳基相连接，荧光强度可增强6～286倍，量子产率增大21～350倍。目前已报道的马来酰亚胺类荧光探针大部分为N-芳基马来酰亚胺。

早在1981年，Sippel报道了N-（4-（7-二乙氨基-甲基香豆素-3-基）苯基）马来酰亚胺（CPM，1）用于硫醇的標记，其化学结构见图2。该探针易于制备和纯化，结构稳定，可溶于简单的溶剂混合物，在pH中性范围内具有高反应性，与硫醇缩合后可产生明亮的蓝色荧光^[9]，基本性质见表1。然而，该探针在检测过程中，背景荧光干扰过大，导致其进一步应用受限。近期，已证明CPM在检测含硫醇基团的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性时，具有显著地荧光增强现象^[10]。

Matsumoto设计合成了基于BODIPY荧光团的探针o-马来酰亚胺-BODIPY（2），其结构见图2。其中，BODIPY作为电子供体，马来酰亚胺部分作为电子受体，基于供体激发光诱导电子转移（d-PET）的机理，使探针发生荧光淬灭^[11]。作者通过比较马来酰亚胺位于BODIPY的邻位、间位和对位时三种探针的荧光强度，发现只有邻位衍生物的荧光几乎完全淬灭，这表明电子供体和电子受体之间的距离越近，荧光被淬灭得越完全。探针2可通过可见光激发，具有极高的信噪比，具体参数见表1，可用于定量标记低浓度的牛血清蛋白（BSA）。

Kand等报道了基于苯并吡喃-喹啉的马来酰亚胺类荧光探针3^[8]，马来酰亚胺位于苯并吡喃-喹啉环的C-4位置，其结构见图2，具有很高的电子密度，时间分辨荧光光谱显示其具有较低的k_r/k_nr值（k_r/k_nr=0.005）。基于ICT原理，探针3显示出对生物硫醇快速且高选择性的响应：与Hcy、Cys和GSH反应，荧光强度分别可提高180、205和245倍，其他荧光性质见表1。其中，对GSH的响应最好，这是因为该探针C-4位置的空间位阻较大，且GSH分子较大，使得马来酰亚胺与喹啉基团几乎处于正交的构象（键角为87.9°），降低了马来酰亚胺对荧光团的淬灭能力。通过使用96孔板系统的裸眼检测以及活细胞成像已证明其可以作为定量硫醇探针使用。

Liu等合成了含有三苯胺和马来酰亚胺的新型硫醇反应型荧光探针4，具体结构见图2，该探针具有良好的水溶性，细胞穿透能力和生物相容性^[12]。在生理pH=7.4条件下，基于探针4浓度的不同，可选择性检测硫醇：浓度较低（0.5 mmol/L）时，Hcy/GSH诱导荧光显著增强（24倍），而Cys几乎没有变化;加大探针浓度至5 mmol/L，可观察到Cys诱导的荧光增强（12倍）。探针4与Hcy和GSH反应时间为75 s，与Cys的反应时间为150 s。此外，该探针已成功应用于活细胞的荧光成像，但是该探针的激发和发射波长均在紫外区域（吸收与发射波长见表1），不利于其进一步应用。

Zhao等基于PET机制和激发态质子转移（ESIPT）机理，开发了用于选择性检测水溶液中硫醇的“Turn-on”型荧光探针5，其化学结构见图2。该探针可以高选择性地检测Cys：具有快速的荧光响应，与Cys的反应在30 s内达到平衡;检测限极低，为3.78×10^-8M （S/N=3）;在生理pH范围内对Cys显示出良好的荧光响应，信噪比较高^[13]。该探针具有良好的细胞膜通透性和对细胞内硫醇的反应性，已成功应用于活细胞中硫醇的成像。

2.1.2  N-烷基马来酰亚胺类荧光探针

N-烷基马来酰亚胺类化合物是一类常见的检测生物硫醇的荧光探针，与芳基直接和马来酰亚胺基团相连接的探针不同，探针和马来酰亚胺中间间隔烷基，此类荧光探针标记效果略低于N-芳基马来酰亚胺类荧光探针，亮度增强5～45倍，量子产率扩大3～20倍。

Lv等报道了一种新的衍生化试剂咔唑-9-乙基-2-马来酰亚胺（CAEM， 6），其中咔唑单元作为核心发色团，马来酰亚胺基团作为反应功能团^[14]。探针化学结构见图3。

该设计大大降低了背景荧光，显著提高了检测灵敏度。在PBS缓冲液（0.02 mol/L， pH=7.5）中，温度40 ℃时，探针6的基本性质见表2，与硫醇反应10 min，即可得到稳定的荧光衍生物。该探针具有较高的巯基选择性，检测限可达到8～17.1 pmol/L。此外，由于其稳定性高，线性范围宽，已成功应用于测定废水样品中的硫醇。

Freimuth报道了基于二氨基对苯二甲酸酯基团的马来酰亚胺类探针7，通过在马来酰亚胺和荧光团之间引入乙基作为连接基团，具体结构见图3，可将发射波长移向光谱的红色区域^[15]。探针7的量子产率非常低（Φ=0.002），荧光基本参数见表2。与苄基硫醇发生共轭加成反应后，荧光可增强20倍。

2.1.3  N-胺基马来酰亚胺类荧光探针

Qu等设计并合成了一种基于1，8-萘二甲酸酐荧光团的马来酰亚胺类新型硫醇反应型荧光探针8，化学结构见图4。该探针在4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（10 mmol/L，pH=7.4）中，随着Hcy浓度的增加，荧光信号逐渐增强，大约为4倍（Φ=0.065～0.192），可直接观察到溶液颜色从无色到蓝色^[16]。对于Hcy、Cys和GSH，其对应检测限分别为：0.144、0.135和0.088 5 μmol/L，其他荧光性质见表3。探针8在实验条件下与硫醇可快速反应（响应时间为20 s），提供了定量检测的可能性，无需对样品进行任何预处理。

Li等合成了含有马来酰亚胺基团的1，8-萘二甲酰亚胺基探针9，化学结构见图4。在HEPES/DMSO （10 mmol/L，pH=7.4） 溶液中，探针9溶液的发射强度与Cys的添加量呈线性关系，并且可以在4.0至11.0的宽pH范围内响应Cys，检测限低至10^-8mol/L，具体荧光性质见表3。检测速度快，对于Cys，Hcy和GSH，反应在120 s内完成^[17]。并且，共聚焦荧光成像实验证明探针9可以很容易地进入细胞并进行硫醇的荧光检测。

2.2  双马来酰亚胺类荧光探针

Girouard报道了一种新的马来酰亚胺类探针10，该探针含有两个连接到萘酰亚胺荧光团的马来酰亚胺基团，其结构见图5。探针10与硫醇和二硫醇反应表明，当其与仅含有一个Cys的蛋白质反应时，不会导致荧光增加;当添加第2当量的硫醇后荧光很快增强，几乎可以定量的转化为二硫醇加合物^[18]。探针10与乙硫醇反应后，在DMSO中发出的荧光强度可增加20倍，该变化在微摩尔浓度很容易被檢测到，其他性质见表4。探针10可对存在两个Cys残基的α-螺旋重组蛋白在体外进行标记。

Castonguay等设计了以荧光素作为荧光团的双马来酰亚胺类探针11，其结构见图5，该探针可与带有两个Cys残基的α-螺旋目标肽序列dC10反应，进行目标蛋白的共价荧光标记。在含有5% DMSO的HEPES （50 mmol/L， pH=7.5） 溶液中，探针11与2 当量的巯基丙酸（MPA）反应后的荧光强度增加5.8倍，见表4。已证明此探针可用于标记表皮生长因子受体 （EGFR），进而提供了膜蛋白特异性标记的可能^[19]。

Clouthier等发表了基于香豆素荧光团的双马来酰亚胺类荧光探针12，其结构见图5。通过引入甲氧基，对马来酰亚胺进行抑制，降低其与GSH反应活性，但保持与dC10α修饰的麦芽糖结合蛋白（MBP-dC10α）的反应性^[20]。探针与测试蛋白MBP-dC10α反应后的荧光增强比率为74，见表4。最重要的是探针12具有无毒性，可不经过洗涤而直接在活细胞中高度特异性地标记巯基蛋白。

2.3  溴代马来酰亚胺类荧光探针

2009年，Baker报道了溴代马来酰亚胺作为可调节的迈克尔受体，其结构见图6，可与Cys迅速反应，是一类用于选择性和可逆修饰Cys的新试剂^[21]。溴代-N-甲基马来酰亚胺（13）可与N-Boc-Cys-OMe快速反应（< 1 min），且通过竞争实验证明溴代马来酰亚胺反应速率快于马来酰亚胺。最特殊的是，探针与Cys反应生成的硫代马来酰亚胺共轭物可用三（2-羧乙基）膦（TCEP）裂解，重新得到Cys，因而13的报道使半胱氨酸的可逆标记成为可能。

基于上述研究，Baker设计并合成了溴代马来酰亚胺类荧光探针14，选择Dansyl作为荧光团，结构见图6。探针14与1当量的N-Boc-Cys-OMe反应^[22]，生成单硫代马来酰亚胺共轭物（Φ=0.049），继续添加1当量的N-Boc-Cys-OMe后，得到的二硫代马来酰亚胺共轭物，并且荧光增强（Φ=0.11）。探针14直接与二硫醇反应，荧光可增强13倍（Φ=0.022～0.28）。证明溴代马来酰亚胺类荧光探针可作为选择性荧光标记二硫醇的新型试剂。

3  结论

近年来，生物硫醇荧光探针研究取得了很大的进展，其中马来酰亚胺类荧光探针由于可选择性的与生物硫醇分子发生反应，一直是研究的热点。然而，对此类探针的研究也面临着新的挑战，如对于Cys、Hcy和GSH的专一性检测报道较少，探针的可逆性标记有待研究，基于体内细胞器靶向的硫醇探针没有重大突破等。因此，未来关于检测生物硫醇的马来酰亚胺类荧光探针的研究重点如下：（1）设计针对生物硫醇分子的专一性检测探针;（2）探究可逆马来酰亚胺类荧光探针的可行性;（3）研究适用于生物细胞器靶向的荧光探针。

參考文献：

[1]Xiaoqiang Chen，Ying Zhou， Xiaojun Peng，et al. Fluorescent and colorimetric probes for detection of thiols[J]. Chemical Society Reviews， 2010， 39：2120-2135.

[2]Hanjing Peng， Weixuan Chen， Yunfeng Cheng，et al. Thiol reactive probes and chemosensors[J]. Sensor， 2012， 12：15907-15946.

[3]Liya Niu， Yuzhe Chen， Hairong Zheng， et al. Design strategies of fluorescent probes for selective detection among biothiols[J]. Chemical Society Reviews， 2015， 44：6143-6160.

[4]Peipei Yan， Ting Wang， Dan Zhang， et al. The progress in fluorescence sensors for detection of thiols[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry， 2018， 38：1-22.

[5]Kevin Renault， Jean Wilfried Fredy， Pierre-Yves Renard， et al. Covalent modi?cation of biomolecules through maleimide-based labeling strategies[J]. Bioconjugate Chemistry， 2018， 29：2497-2513.

[6]Ravasco， Joao M. J. M.; Faustino， Helio; Trindade， Alexandre. Bioconjugation with maleimides： a useful tool for chemical biology[J]. Chemistry-A European Journal， 2018， 25：43-59.

[7]Yongzhi Lv， Xueyi Feng， Luxiang Liu， et al. The review of luminescence mechanism of fluorescent probes[J]. Fujian Analysis and Testing， 2017， 26：25-30.

[8]Dnyaneshwar Kand， Arunasree Marasanapalli Kalle ， Pinaki Talukdar. Chromenoquinoline-based thiol probes： a study on the quencher position for controlling fluorescent off-on characteristics[J]. Organic & Biomolecular Chemistry， 2013， 11：1691-1701.

[9]Sippel， T. O. New fluorochromes for thiols： maleimide and iodoacetamide derivatives of a 3-phenylcoumarin fluorophore[J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry， 1981， 29：314-316.

[10]Tielong Gao， Chao Yang， ， Yujun George Zheng. Comparative studies of thiol-sensitive fluorogenic probes for HAT assays[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2013， 405：1361-1371.

[11]Takuya Matsumoto， Yasuteru Urano， Takuji Shoda， Hirotatsu Kojima， and Tetsuo Nagano. A thiol-reactive fluorescence probe based on donor excited photoinduced electron transfer： key role of ortho substitution[J]. Organic Letters， 2007， 9：3375-3377.

[12]Tao Liu， Fangjun Huo， Caixia Yin， et al. A triphenylamine as a fluorophore and maleimide as a bonding group selective turn-on fluorescent imaging probe for thiols[J]. Dyes and Pigments， 2016， 128：209-214.

[13]Yun Zhao， Yuanyuan Xue， Haoyang Li， et al. An excited state intramolecular proton transfer dye based fluorescence turn-on probe for fast detection of thiols and its applications in bioimaging[J]. Spectrochimica Acta Part A： Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2017， 175：215-221.

[14]Zhengxian Lv， Zhiwei Sun， Cuihua Song， et al. Sensitive and background-free determination of thiols from waste water samples by MOF-5 extraction coupled with high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using a novel fluorescence probe of carbazole-9-ethyl-2-maleimide[J]. Talanta， 2016， 161： 228-237.

[15]Lena Freimuth，Jens Christoffers. Bifunctional diaminoterephthalate scaffolds as fluorescence turn-on probes for thiols[J]. Chemistry-A European Journal， 2015， 21：8214-8221.

[16]Lijun Qua， Caixia Yina， Fangjun Huo， et al. A maleimide-based thiol fluorescent probe and its application for bioimaging[J]. Sensors and Actuators B Chemical， 2014， 195：246-251.

[17]Tao Liua， Fangjun Huo， Jianfang Li，et al. A fast response and high sensitivity thiol fluorescent probe in living cells[J]. Sensors and Actuators B Chemical， 2016， 232：619-624.

[18]Alain Grandbois， Jeffrey W. Keillor， Stephen W. Michnick， et al. Synthesis and characterization of dimaleimide fluorogens designed for specific labeling of proteins[J]. Journal of the American Chemical Society， 2005， 127：559-566.

[19]Julia Guy， Roselyne Castonguay， Stephane Dufresne， et al. De novo helical peptides as target sequences for a specific， fluorogenic protein labelling strategy[J]. Molecular BioSystems， 2010， 6： 976-987.

[20]Yingche Chen， Christopher M. Clouthier， Kelvin Tsao， et al. Coumarin-based fluorogenic probes for no-wash protein labeling[J]. Angewandte Chemie International Edition， 2014， 53：13785-13788.

[21]Lauren M. Tedaldi， Mark E. B. Smith， Ramiz I. Nathani， et al. Bromomaleimides： new reagents for the selective and reversible modification of cysteine[J]. Chemical Communications， 2009， 6583- 6585.

[22]Judith Youziel， Ahmed R. Akhbar， Qadeer Aziz， et al. Bromo- and thiomaleimides as a new class of thiol-mediated fluorescence ‘turn-on reagents[J]. Organic & Biomolecules Chemistry， 2014， 12： 557-560.