药物相关性颌骨坏死发病机制的研究进展

郭陟永 刘济远 李春洁 唐休发

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院头颈肿瘤外科 成都 610041；2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院口腔颌面外科 成都 610041

双膦酸盐（bisphosphonates，BPs）类药物作为一种强有力的骨吸收抑制剂，主要应用于骨质疏松、Paget病、多发性骨髓瘤的治疗以及乳腺癌、前列腺癌骨转移的预防。患者在接受包括唑来膦酸（zoledronate，ZOL）和帕米膦酸（pamidronate，PAM）等BPs治疗后，可能产生一种十分严重的并发症——双膦酸盐相关性颌骨坏死（bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw，BRONJ）。近来发现一些其他的抗血管新生、抗骨吸收药物，如狄诺塞麦（denosumab）等，也可造成颌骨坏死[1]。因此2014年美国颌面外科医师协会建议使用药物相关性颌骨坏死（medication-related osteonecrosis of the jaw，MRONJ）代替BRONJ这一名词，并更新了诊断标准：1）曾经或正在接受抗骨吸收或抗血管生成治疗；2）颌面部死骨暴露或能通过口内、口外的瘘道探查到死骨，并持续8周以上；3）颌骨无放射性治疗史且不存在明显的肿瘤转移性疾病[1]。

MRONJ患者可出现持续疼痛、流脓、张口受限、经久不愈的皮瘘甚至病理性骨折等，严重影响患者的生活质量，但目前医学界还缺少有效的应对措施。对于早期的患者，临床上主要以健康教育、使用抗生素、控制疼痛、使用漱口水等方式控制病情进展。当病情进展至三期时需采用清创，甚至手术切除病变等方式进行治疗，但是效果欠佳，病情容易进展和复发[1]。其他治疗，如高压氧治疗、激光治疗、生长因子治疗、重组人甲状旁腺激素治疗等方法，还处于研究当中，治疗效果不确切，无法推广使用[2-3]。因此，国内外学者将研究的重点转移至MRONJ发病机制上，希望通过对其发病机制的深入研究，寻找更有效的治疗靶点。目前有关MRONJ的发病机制，学者们已经提出了多种假说，主要包括骨重建抑制、血管生成减少、口腔内微生物感染、免疫抑制等，但是其确切的发病机制仍不清楚[4]。本文就近年来MRONJ发病机制研究的进展作一综述，以期为进一步的研究提供帮助。

1 骨重建抑制学说

颌骨是一个新陈代谢活跃的器官，在整个生命过程中不断进行重塑，以保持其结构的完整性和钙稳态。骨重建依赖于破骨细胞（osteoclasts，OCs）骨吸收和成骨细胞（osteoblasts，OBs）骨基质形成之间的精妙平衡，涉及一系列复杂的、高度调控的顺序步骤。不管是BPs或是核因子κB受体激活剂配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）单抗药物，均可直接或间接抑制OCs和OBs的形成及功能，抑制骨吸收的同时减少骨新生，抑制骨重建过程，导致骨质量降低，最终诱发MRONJ。BPs可以直接抑制OCs功能并诱导其凋亡[5-6]。OCs是一种由多个单核细胞融合形成的多核巨细胞，其特征包括：1）可以形成封闭区（sealing zones），使其黏附于骨表面进行骨吸收；2）具有富含骨吸收相关蛋白的褶皱边缘；3）可以通过胞浆内囊泡转运骨的降解物。BPs可以改变OCs的形态，减少褶皱边缘，抑制胞浆内囊泡的形成，并减少封闭区[7]。Rogers等[8]证明，BPs可以抑制甲羟戊酸途径，阻止小G蛋白异戊烯化，从而抑制OCs骨吸收功能。此外，BPs与钙离子形成螯合物可以和骨表面的羟磷灰石结合，通过促进释放可溶性因子抑制OCs的形成[9]。BPs对OBs作用的研究则相对较少。Giannasi等[10]证明，BPs可以抑制OBs碱性磷酸酶的活性，减少矿化结节的沉积。Manzano-Moreno等[11]通过体外实验证明了高浓度的BPs（≥10 mol·L−1）可以改变OBs生理必需基因的表达，阻滞其细胞周期，诱导其凋亡和坏死。有些研究则得出了不同的结论。一项随机对照试验[12]发现，长期使用阿仑膦酸钠（alendroante，ALN）的患者骨组织中OCs数量较对照组更多，但形态与正常OCs不同。类似的研究结果在小鼠动物模型中也得到了验证[13]。这种异常的、增加的OCs在MRONJ的发病过程中发挥怎样的作用目前还有待研究。

目前绝大多数的研究局限于单一种类细胞，而骨重建是由多个细胞组成的基本多细胞单元（basic multicellular unit，BMU）共同完成的[14]。由BMU内多细胞互相调节的微环境的稳定对于骨重建平衡有至关重要的作用。Hattner等[15]观察到，OCs进行骨吸收的位点会有OBs聚集并成骨的现象，由此提出了骨重建过程中耦合（coupling）的概念。耦合因子（coupling factor）是在OCs骨吸收过程中释放的可以调节OBs作用的一类因子，OCs不仅可以直接进行骨吸收，而且能够通过耦合因子调节OBs从而影响骨重建过程。而BPs可以通过改变BMU内的微环境，干扰耦合过程。Shimizu等[16]发现，ALN可以通过OCs膜结合因子EphrinB1改变OBs的活性。BPs对于骨微环境的改变是该领域未来的一大研究热点，可能成为揭示MRONJ发病机制的关键。

2 血管生成抑制学说

新生的血管或未成熟毛细血管是组织稳态、局部免疫和组织再生或修复的必要条件，特别是对于代谢、改建活跃的颌骨。一些学者[17-18]发现，BPs可以有效地抑制多种肿瘤中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，包括非小细胞肺癌和乳腺癌等，在此基础上提出血管生成抑制学说，即BPs可以抑制颌骨内的血管生成，造成局部骨质的缺血状态，经拔牙或其他牙科治疗等造成的创伤后可以诱发MRONJ。

Wehrhan等[19]通过对比MRONJ患者与正常人的黏骨膜样本，发现CD31+的微血管生成在两组中无明显差异，而CD105+的新生血管在MRONJ患者的样本中明显减少。在接受BPs药物治疗后，血清中VEGF、白细胞介素（interleukin，IL）-17以及其他与血管生成相关因子的表达水平会明显下降[20-21]。体外研究[22]证明，低剂量的ZOL可以明显抑制内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的分化，而高剂量的ZOL可以诱导其凋亡。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的黏附、迁移等能力也被ZOL明显抑制[23-24]。此外，一些针对VEGF或VEGF相关通路的药物，如贝伐单抗、舒尼替尼、雷帕霉素等也被报道可以诱发骨坏死，这在一定程度上支持该学说[25-27]。但是该学说尚无法解释RANKL单抗类药物可以诱发MRONJ。一项体外试验[28]表明，与ZOL相比，狄诺塞麦对于HUVEC并无直接抑制作用。一个可能的解释是，ZOL可以通过抑制破骨前体细胞分泌血小板源性生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGFBB）从而抑制血管的新生，而狄诺塞麦可以通过抑制OCs的形成达到相似的效果[29]。而另一项体外研究[30]则得出相反的结论，原代培养的人牙龈成纤维细胞受ZOL刺激后可以高表达VEGF和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2），从而产生一个促进血管新生的微环境。虽然BPs对于血管内皮细胞的直接抑制作用在体外试验中已经得到了充分的验证，但其在体内复杂环境下的作用尚需进一步探究。

3 口腔微生物感染学说

考虑到口腔是一个复杂的有菌环境，部分学者提出微生物感染可能是MRONJ的发病机制之一[31]。放线菌是口腔内主要定植菌的一种[32]。在口腔黏膜屏障完好的生理情况下，放线菌对于口腔黏膜毒性很低，而当黏膜屏障受损至颌骨暴露时，放线菌则可能产生致病作用[33-34]。放线菌在MRONJ病灶中的检出率为39%～100%不等[35-36]。Pushalkar等[34]比较了接受或未接受过BPs治疗的牙周病患者以及MRONJ患者组织样本中的微生物构成，发现厚壁菌、梭杆菌及放线菌在MRONJ组中占比更高，而变形菌、拟杆菌在未使用BPs的患者中占比更高。另一项研究[31]显示，在MRONJ患者的骨和软组织标本中，链球菌、放线菌、普氏菌占比最高。病灶中的放线菌主要是从黏膜下和坏死的骨中检出的，病变底部正常骨组织中的放线菌非常少。目前MRONJ微生物感染假说研究的一大障碍是对于MRONJ患者口腔微生物的生态学知之甚少。大多数研究仅仅为横断面描述性研究，而对于口腔微生物组群（oral microbial community）的具体组成、分类学多样性及相关微生物的功能潜能研究不足，这极大地限制了该领域的研究进展。宏基因组学（metagenomic）技术可以不经预先培养，直接利用取得的样本通过基因芯片或是基因测序等手段高通量地直接对微生物进行研究。Sedghizadeh等[37]通过宏基因组学的手段发现，MRONJ患者的唾液样品中，病毒比微生物细胞的丰度要高出一个数量级，并且主要由噬菌体构成。他们推测MRONJ患者口腔内特定生物膜的形成可以促进病毒和宿主之间的溶原性反应，这或许与MRONJ的发生发展有关。笔者认为，高质量的、大样本的宏基因组学研究可以有力地推进该领域的进展。

目前微生物感染学说也存在争议。Kalyan等[38]研究表明，口腔微生物的组成与MRONJ并无相关性。Silveira等[39]通过动物实验证明了微生物定植并不会导致骨坏死的产生。不仅如此，对于是先发生骨坏死后才有特异的微生物定植，还是微生物感染后才诱发骨坏死的发生，目前学术界尚无定论。

4 免疫抑制学说

MRONJ患者大多有长期糖皮质激素使用史，或是患有恶性肿瘤，或者接受过化疗，处于免疫抑制状态。免疫系统可以参与骨质流失（bone loss）和骨再生（bone regeneration）的过程。例如，αβT细胞可以通过分泌炎症相关的细胞因子引起骨质流失，而γδT细胞在骨再生过程中发挥着重要的作用[40]。结合这些证据，部分学者推测患者免疫功能紊乱也是MRONJ可能的发病机制之一。

BPs可以直接调控免疫细胞的生物学行为。Wolf等[41]通过体外实验证明了治疗剂量的ZOL可以直接调控骨髓细胞（myeloid cell）的分化及功能，如树突状细胞、巨噬细胞等。ZOL能够直接抑制树突状细胞的成熟，减弱树突状细胞介导的T细胞活化[42]。同时，ZOL可以抑制未成熟树突状细胞和巨噬细胞的吞噬功能[41]。Zhang等[43]通过体内实验证实，ZOL可以通过上调IL-17的表达激活信号传导与转录活化因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT-1）信号通路，从而上调巨噬细胞M1/M2的比例，这与MRONJ的发生密切相关。γδ T细胞可以通过分泌IL-17等促进骨形成，参与骨折愈合过程。Kalyan等[38]发现，接受BPs治疗的骨质疏松患者的外周血中Vγ9Vδ2 T细胞数量明显减少。另一项研究[44]则发现，MRONJ患者病灶区γδ T细胞浸润明显上升（占淋巴细胞90%），而在生理情况下外周血中γδ T细胞占比仅为2%～5%。该研究还发现[44]发现，相较于野生型小鼠，敲除了γδ T细胞的小鼠不容易出现骨坏死；但是Park等[45]则认为，γδ T细胞并没有影响骨坏死发生的核心机制，仅与MRONJ不同的黏膜表现有关。中性粒细胞对于伤口愈合起到了至关重要的作用，但体外试验[46]表明，BPs可以明显抑制中性粒细胞的趋化能力、吞噬功能和氧爆作用（oxida-tive burst）。

OCs作为一种单核细胞分化而来的细胞，可以通过分泌细胞因子和趋化因子等如IL-6、IL-10等，广泛地参与到免疫调节的过程中，并且OCs自身也受到免疫细胞的调控。自然杀伤（natural killer，NK）细胞可以通过分泌干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）抑制OCs的形成，而OCs可以激活NK细胞，促进其增殖和功能[47]。Tseng等[48]的研究发现，ZOL可以通过抑制OCs进而抑制NK细胞，从而在拔牙窝的软组织处形成一个免疫抑制的微环境，这可能与MRONJ的发生、发展密切相关。不仅如此，还有研究[49]表明，OCs可以调控T细胞的功能，而T细胞的功能可能与MRONJ发生有关。目前免疫抑制学说尚无法解释RANKL单抗类药物导致的MRONJ，导致该学说的可信度降低。笔者推测RANKL单抗药物可能通过调节OCs间接调节免疫系统，但是还需相关实验进行探索。BPs对于OCs免疫作用的调节可能是下一步研究的热点。

5 其他

考虑到BPs的毒性，也有学者[50]提出，BPs可以直接损伤口腔软组织屏障，使拔牙创延期愈合，导致微生物更易定植、入侵，从而产生骨坏死。体外实验[51-52]证实，BPs可以抑制成纤维细胞和角质细胞的增殖和迁移能力，并诱导其凋亡。动物实验[50,53]也证实，BPs可以损伤胃黏膜和口腔黏膜的功能。此外，成纤维细胞和角质细胞都可以通过分泌细胞因子参与骨重建过程，因此BPs可能通过抑制成纤维细胞和角质细胞从而间接抑制骨重建过程。

已有研究[54-55]表明，长期使用BPs可以导致颌骨产生微裂纹（microcrack），并且微裂纹的产生与OCs功能的抑制密切相关。组织学检测可见微裂纹中有侵入细菌和白细胞的聚集，因此微裂纹有可能作为通道使得微生物深入骨质，产生骨坏死。Hoefert等[56]通过扫描电子显微镜对比MRONJ、骨髓炎、放射性颌骨坏死等患者的组织标本，发现微裂纹在54%的MRONJ标本中可以见到，并且局部炎症及结缔组织反应在微裂纹处更加明显。Kim等[57]通过对大鼠组织样本进行分析，发现MRONJ组微裂纹的数量和长度都远高于对照组。

一些证据表明基因因素可能在MRONJ的发病过程中发挥着重要的作用，特别是单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）[58]。通过药物基因组学的手段发现了许多潜在的致病位点，主要包括CYP2C8（rs1934951）、PPARG（rs1152003）、VEGF（rs3025039、rs699947、rs2010963）等[58-62]。然而系统评价[58]结果显示，CYP2C8（rs1934951）、VEGF（rs3025039）与MRONJ发病相关，其他位点的合并结果为阴性。考虑到目前该领域的研究证据质量较低，尚无法得出确切结论。通过大样本、跨国、多中心的临床研究才能得出更为可靠的结论。

6 结论及展望

本文总结并讨论了目前主流的MRONJ发病机制假说的研究进展。目前，学术界对于MRONJ的发病机制还未能达成共识。需要指出的是，虽然本文将不同的假说分开叙述，但许多学者认为MRONJ的发病可能是多因素协同作用的结果。例如，因拔牙、BPs毒性作用而受损的黏膜屏障导致特定微生物的定植，微生物通过微裂纹进一步感染深部骨质，再加上宿主全身或局部的免疫失调，多种因素协同作用最终导致MRONJ的发生。笔者认为，针对单个假说的研究似乎已遇到了瓶颈，而多个假说的交叉领域，如骨免疫，也许是揭示MRONJ发病机制的关键。此外，MRONJ的研究有赖于可靠的体内实验，而非单纯的体外实验。有学者[63]认为，小型猪的动物模型也许更加接近人体，因此更加适用于MRONJ发病机制的研究。

MRONJ在临床上并非罕见病，且治疗效果并不理想。能做到针对发病机制的干预无疑是最理想的，然而彻底揭示其发病机制依然任重而道远。