低浓度过氧化氢溶液在高温时用于组织脱黑色素的效果

陈永华，林碧芸，李小芳，李南红，袁振兴

临床上含有黑色素的肿瘤较多，良性的有痣，恶性的有黑色素瘤、原始神经外胚层肿瘤、透明细胞肉瘤等，免疫组化是鉴别上述肿瘤的重要辅助手段，然而黑色素的存在，严重影响免疫组化结果的判读。因此，寻找一种对组织结构及免疫组化指标表达影响尽可能小的脱黑色素方法对病理诊断意义重大。目前，常用的脱色素法有高锰酸钾/草酸法和过氧化氢法，均可以把色素脱除干净，但是会破坏组织。本科室采用两种pH的溶剂配制浓度为1.8%的H2O2溶液在70 ℃时对组织进行脱色素处理，并行免疫组化染色，取得良好效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取我院2015年1月～2017年12月病理确诊为黑色素瘤，且富含黑色素颗粒的12例存档蜡块。另选取3例HE染色显示极少黑色素的黑色素瘤作为对照组。

1.2 试剂双氧水消毒液购自南国药业公司，分析纯氢氧化钠购自天津凯通化学公司，PBS、一抗Ki-67、HMB-45及免疫组化MaxVison试剂盒，均购自福州迈新公司。

1.3 方法

1.3.1实验分组 所有标本均经10%中性缓冲福尔马林固定8～36 h，常规脱水、透明和石蜡包埋，4 μm厚切片，每例蜡块切9张白片，用氨丙基三乙氧基硅烷(APES)黏附载玻片捞片，经65 ℃烤片2 h。实验分为未处理组、PBS组、NaOH组。

1.3.2脱黑色素 富含黑色素组织与极少色素组织分别切片于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，梯度乙醇水化，自来水冲洗并浸泡于蒸馏水中待用，若手工方法做免疫组化染色，切片经抗原修复后冷却至室温，水洗待用，经预先在水浴箱孵育至70 ℃分别由PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制浓度为1.8%的H2O2溶液，每隔10 min取出镜下观察，直至黑色素完全褪去，记录时间。若150 min内未褪去全部黑色素，亦停止脱黑色素。不做脱色素处理的切片脱蜡至水即可，然后复染苏木精，脱水、透明、封固。

1.3.3免疫组化 富含黑色素组织与极少色素组织分别选取Ki-67、HMB-45抗体行免疫组化染色。(1)未处理组：组织切片抗原修复至常温后，切片滴加过氧化物酶阻断剂孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次；除去PBS后，滴加一抗室温下孵育60 min，PBS冲洗3 min×3次，采用免疫组化MaxVison法进行检测。(2)脱黑色素组：切片经抗原修复后，PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制浓度为1.8%的H2O2溶液处理，流水冲洗10 min，采用免疫组化MaxVison法进行检测(图1)。

图1 实验步骤示意图

2 结果

未处理组的切片，经脱蜡复染苏木精后组织可见大量棕黄色的黑色素颗粒覆盖在肿瘤细胞上，进行免疫组化染色时黑色素颗粒与DAB显色的颜色互相混淆，无法分辨(图2)。

本实验是温度为70 ℃时玻片经脱黑色素处理后，所有组织在PBS(pH 7.4～7.6)配制的1.8%H2O2溶液中100～130 min黑色素可完全脱去，且组织结构完整，无脱片现象；在NaOH(pH 10.0)配制的溶液经70～90 min黑色素可完全脱去，组织结构基本完整，组织稍有卷曲。两种脱色素处理后的切片均行免疫组化HMB-45染色，可见肿瘤细胞的胞质呈棕黄色，免疫组化Ki-67染色可见部分细胞核呈棕黄色(图2)。

极少黑色素组中未做处理与两种pH溶剂配置的1.8% H2O2溶液处理的苏木精复染与免疫组化染色结果基本一致。

3 讨论

黑色素是一种黄褐色或棕褐色的细颗粒，大小不等，形状不一，性质稳定，来源于神经脊，在胚胎发育过程中，由神经脊移行到皮肤等处。正常情况下黑色素存在于毛发、皮肤基底层等，在病理情况下，黑色素多见于恶性黑色素瘤及一些良性病变，如色素痣等。免疫组化染色应用DAB显色系统时，黑色素颗粒的存在会影响组织病理学评估。因此，需进行脱黑色素处理。

颜亚晖等[1]在标本脱水前就进行脱黑色素处理获得较好的效果，但该方法耗时较长，且脱黑色素时间与黑色素的含量呈正比，脱色时间难以掌握。吴琼等[2]在常规免疫组化染色DAB步骤后，应用甲苯胺蓝溶液或Giemsa溶液把黑色素复染为可以区分DAB色素中的黑色素颗粒。该方法将肿瘤细胞表达抗原用DAB染成棕色并将黑色素颗粒染成墨绿色或者绿色，当黑色素较少且无覆盖组织时效果较好；若黑色素较多时，染色后的黑色素颗粒，物理遮盖的问题仍然存在，遮盖物会影响免疫组化结果的判断。因此，不适用于含大量黑色素的组织。高锰酸钾-草酸脱黑色素是使用最广泛的漂白方法，虽然其快速有效，但于晓东等[3]认为传统的高锰酸钾法容易掉片，在加热煮沸的情况下易加剧脱片的几率[4]，且漂白使组织损伤和细胞分子丢失，后续免疫组化染色的强度与定位受影响较大[5]。

图2 富含黑色素的未处理组与PBS、NaOH组处理脱色素景深扫描及免疫组化HMB-45、Ki-67染色，MaxVision法

H2O2法也常用于脱黑色素，室温下对组织的抗原性基本无影响，但耗时较长，无法满足临床诊断的需求[3,6]。陈琼荣等[7]采用3% H2O2在55 ℃处理2 h严重脱片。本实验选取1.8% H2O2溶液，把温度提高至70 ℃，经实验验证组织完全脱去色素后，结构完整，无脱片现象，且对后续免疫组化指标Ki-67及HMB-45染色无影响。

本科室经过反复实验，采用PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制的1.8% H2O2溶液在70 ℃时经70～130 min将色素脱干净，组织结构完整。极少黑色素组未做处理与两种pH溶剂配置1.8% H2O2溶液处理的苏木精复染与免疫组化结果基本一致，证明两种脱黑色素法在完全脱去黑色素的时间内对免疫组化染色的影响较小。该方法能够满足临床、病理医师对含有黑色素肿瘤的诊断及鉴别诊断，耗时较短，值得推广应用。