石蜡切片免疫组化套染PAS在肾活检组织病理诊断中的应用

弓玉祥，陈平圣,2，杨旻宇

在肾穿刺组织的病理诊断中，采用常规冷冻切片免疫荧光染色、石蜡切片HE染色、PAS染色、Masson染色、PASM染色以及电镜观察，以得到准确的病理诊断。但由于肾穿刺为有创性检查，再加上术者技术精疏有别以及患者个体差异，不仅所取组织十分细小，而且标本质量亦常不尽人意；另外，没有能力购置电镜的单位难以做超微诊断。因此需要我们摸索新的方法，以达到最大限度获得疾病信息，同时又省时、省力，且节约成本。作者实验室前期已经建立了石蜡切片免疫荧光染色法，其他学者也有相关报道[1-3]。最近又建立了肾活检组织石蜡切片免疫组化结合PAS染色方法，取得了较好的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2003年以来东南大学附属中大医院肾内科住院患者及外院送检标本，经肾活检组织诊断IgA肾病和膜性肾病的患者标本合计70例，进行回顾性分析。

1.2 实验试剂0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)、0.5%过碘酸、10%冰醋酸、5%盐酸乙醇、5%氨水乙醇、PAS染液、苏木精染液，均为本实验室自制。粉剂型抗原修复原液[柠檬酸法pH (6.0±0.1)]购自福州迈新公司。FITC标记的兔抗人IgA、IgG多克隆抗体(稀释倍数1 ∶40)；兔抗人IgA、IgG多克隆抗体(即用型)、内源性过氧化物酶阻断试剂(即用型)、酶标羊抗兔抗体(即用型)、胰酶(即用型)，均购自北京中杉金桥公司。DAB显色试剂盒(即用型)购自福州迈新公司。

1.3 实验仪器透射电镜(日立公司，日本)；荧光显微镜(奥林巴斯公司，日本)；冷冻切片机(徕卡公司，德国)；恒温水浴箱(国产)。

1.4 标本制备肾活检标本按常规方法分别制作冷冻切片、石蜡切片和超薄电镜切片。冷冻切片厚4 μm，石蜡切片厚2 μm。制作过程中，组织经10%中性福尔马林于4 ℃冰箱中固定4～48 h，常规脱水，浸蜡时间不超过4 h，温度控制在60～62 ℃。

1.5 染色方法冷冻切片免疫荧光染色采用一步法[2]。免疫组化套染PAS步骤如下：(1)石蜡切片二甲苯脱蜡2次，每次20 min，80%～100%梯度乙醇至水，每次均为5 min。(2)微波热修复抗原，切片浸泡于柠檬酸缓冲液中，中火4 min，停火4 min，后低火4 min，将切片自微波炉中取出，自然冷却至室温；置于PBS缓冲液中，3 min×2次，再将切片滴加胰酶，37 ℃孵育15 min，进一步暴露抗原，PBS浸泡3次，每次3 min。(3)加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min，PBS浸泡3次，每次3 min。(4)加兔抗人IgA或IgG抗体，37 ℃孵育60 min，PBS浸泡3次，每次3 min。(5)加酶标二抗，室温孵育20 min，PBS浸泡3次，每次3 min。(6)加新鲜配置的DAB显色剂5～8 min，自来水洗。(7)加0.5%过碘酸10 min，自来水洗，自来水浸泡5 min。(8)加PAS染液20 min，自来水洗，浸泡蒸馏水中10 min。(9)2 mol/L H2SO4酸化2 min，水洗。(10)加苏木精染色液15 min，自来水洗，5%盐酸乙醇1～2 min，自来水洗，5%氨水乙醇1～2 min，自来水洗。(11)梯度乙醇脱水，透明，封固。

2 结果

膜性肾病组织免疫荧光染色显示翠绿色颗粒状荧光沿肾小球毛细血管壁分布；电镜下见肾小球毛细血管基膜外上皮下团块状电子致密物沉积。IgA肾病组织显示肾小球系膜区团块状或鹿角状绿色荧光，电镜下见系膜区团块状电子致密物沉积。套染切片组织结构清晰，色彩鲜艳；免疫复合物呈团块状或颗粒状沉积在肾小球系膜区或毛细血管壁，沉积部位和方式与冷冻切片免疫荧光及电镜观察一致；组织结构与单纯PAS染色相似，细胞核着色稍浅(图1、2)。

3 讨论

肾穿刺活检病理诊断是肾脏疾病诊断的金标准，是临床有效治疗的基石，而准确的病理诊断依赖于可靠的技术支撑[4]。活检组织量尽管很少，但是为了准确诊断，必须把组织制备成冷冻切片、石蜡切片和电镜超薄切片，再进行各种染色以备观察[5]。

图1膜性肾病组织不同染色方法比较：A.冷冻切片免疫荧光染色；B.单纯PAS染色；C.电镜；D.免疫组化+PAS套染图2IgA肾病组织不同染色方法比较：A.冷冻切片免疫荧光染色；B.单纯PAS染色；C.电镜；D.免疫组化+PAS套染

石蜡切片HE染色用于观察肾组织的基本结构，分辨细胞种类；PAS染色可用于观察肾小球和肾小管基膜以及系膜基质的多寡，还可用于特殊病原体的检测[6]；Masson染色可显示基膜及细胞外基质增多，用于观察肾间质纤维化及某些特殊蛋白沉积，如免疫复合物。冷冻切片免疫荧光染色用于检测沉积于肾组织内免疫球蛋白、补体、纤维蛋白以及病毒抗原等。借助电镜可观察肾脏超微结构改变，如肾小球基膜厚度和结构、肾脏固有细胞形态、电子致密物及其沉积部位、特殊的纤维素样物质和病毒样颗粒等。

然而，在临床实际工作中，常因检材太少或条件有限，难以进行上述各种检查，增加了诊断的不确定性。作者通过反复摸索，成功建立了免疫组化与PAS套染方法。与单纯PAS染色、直接免疫荧光染色和电镜观察作对比，无论组织结构、免疫复合物沉积的方式、部位等方面均取得了满意效果。因此，作者认为该方法可以在缺少免疫荧光和电镜标本或两种样品缺少肾小球的情况下使用，兼具PAS染色、免疫荧光染色和电镜检查的部分功能，克服了PAS染色只能显示组织的显微结构、免疫荧光只检测抗原沉积、电镜观察范围太小等不足，初步起到确定诊断的作用，同时还节约了检材、制样及观察时间。另外该方法也可在没有经费购买电镜、荧光显微镜、冷冻切片机的普通医院病理科使用，能显著提高肾活检病理诊断的准确性。

在上述套染的实际操作过程中，作者有以下几点体会：(1)穿刺组织固定必须充分，固定液使用10%中性缓冲福尔马林为宜；(2)免疫组化抗原修复方法很多，但微波修复+胰蛋白酶消化为抗原修复的最佳方法；(3)PAS染色液及0.5%过碘酸需新鲜配制；(4)苏木精染色前应将切片酸化，用2 mol/L H2SO4酸化2 min，效果比使用同样浓度的盐酸更佳，苏木精染色时间需适当延长。

总之，本实验采用免疫组化+PAS套染法虽然步骤较多，但内容简单，便于操作，染色结果清晰，便于推广应用。