结肠癌组织中CDC6的表达及临床意义

罗志飞，黄幼生，解 娜，杨 丞，阮细玲，张艺馨，王惟江，王敏健

结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭、转移是提高患者生存率的重要途径，寻找结肠癌增殖、侵袭、转移的分子靶标对判断预后、设计靶点药物及提高治疗水平具有重要意义[1]。CDC6属于ATP酶家族成员之一，是形成复制前复合物的主要成分，参与DNA复制，促进细胞周期转换，诱导细胞增殖[2-3]，在多种肿瘤中存在高表达[4-8]，但在结肠癌组织中的表达尚不清楚。本文应用免疫组化MaxVision法检测CDC6在结肠癌组织中的表达，并分析其与结肠癌临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2011～2012年海南医学院第一附属医院病理科存档的121例结肠癌标本，所有病例均有完整的临床病理资料，其中73例有5～6年的随访资料，患者术前均未接受放、化疗。本实验采用AJCC第8版对结肠癌进行病理分期。

1.2 组织芯片制作以结肠癌、癌旁正常黏膜组织制作芯片，光镜下选择HE标本进行定位、标记(避免出血、坏死等部位)。每个标本取2个位点，按18×12的阵列按顺序排放，在阵列孔的左上方第一排的第一个孔放置正常肝组织，避免混淆。

1.3 免疫组化采用免疫组化MaxVision法进行染色。常规切片、脱蜡、水化，经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶5 min。1 mmol/L Tris-EDTA(pH 8.0)煮沸修复30 min，CDC6一抗(1 ∶400，Abcam公司)37 ℃ 1 h。PBS清洗5 min×3次，二抗(福州迈新公司)孵育20 min。PBS清洗5 min×3次，DAB显色(福州迈新公司)，苏木精衬染1 min。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判读CDC6阳性着色为细胞质及细胞核着色，呈棕黄色至棕褐色。根据细胞着色强度计分：浅棕色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分；根据阳性细胞数百分比计分：<5%为1分，≥5%为2分。两者评分结果相乘作为最终评判：<3分为低表达，≥3分为高表达。

1.5 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计数资料用百分比或率表示，采用χ2检验；CDC6表达与结肠癌临床病理特征的关系采用χ2检验比较；应用Kaplan-Meier进行生存曲线描绘，并用Log-rank检验进行比较分析，以Cox回归模型进行多因素分析，筛选预后相关因素。显著性检测水准α值=0.05，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDC6在结肠癌及癌旁正常黏膜组织中的表达在癌旁正常黏膜组织中，CDC6不表达或低表达，均为细胞核着色，阳性率为5.79%(7/121)。CDC6在结肠癌组织为细胞质、细胞核双表达，以细胞质表达为主，阳性率为80.2%(97/121)，细胞核阳性率为29.8%(36/121)，总阳性率为93.39%(113/121)，强阳性率为68.60%(83/121)；与癌旁正常黏膜组织相比，差异有显著性(P<0.001，图1)。

2.2 CDC6表达与结肠癌临床病理特征的关系CDC6的表达与临床分期及远处转移明显相关(P<0.05)；与淋巴结转移明显相关(P<0.05)，N0+N1期结肠癌CDC6表达强度明显低于N2期结肠癌，差异有显著性(P<0.05)；但CDC6表达与患者性别、年龄等无关(P>0.05，表1)。

2.3 CDC6表达与结肠癌患者预后的关系121例结肠癌患者中93例进行随访，其中73例有完整的5年随访资料，对73例进行Kaplan-Meier法生存分析，结果显示CDC6高表达组的中位生存期(54.49个月)明显低于低表达组(69.09个月)，差异有统计学意义(F=4.07，P=0.047)；CDC6低表达组5年生存率为81.82%(18/22)，明显高于高表达组54.9%(28/51)，差异有显著性(χ2=17.19，P<0.01，图2)。

图1CDC6在结肠癌、癌旁正常黏膜组织中的表达，MaxVision法：A.例1癌旁正常黏膜组织中CDC6呈阴性；B.例1结肠癌组织CDC6细胞呈阳性；C.例2癌旁正常黏膜组织中CDC6呈阴性；D.例2结肠癌组织中CDC6呈细胞核、细胞质阳性；E.例3癌旁正常黏膜组织中CDC6呈阴性；F.例3结肠癌组织中CDC6呈细胞核阳性

表1 结肠癌临床病理特征与CDC6表达的关系

2.4 结肠癌患者预后Cox多因素分析经χ2检测，结肠癌患者生存状态与临床分期、肿瘤分级、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及CDC6高表达相关(表2)。进一步Cox多因素回归分析表明肿瘤远处转移、临床分期及CDC6高表达是结肠癌预后的独立风险因素(表3)。

表2 结肠癌临床病理特征、CDC6表达与预后的关系

表3 Cox回归模型分析结肠癌患者预后

图2 CDC6表达结肠癌患者的生存曲线

3 讨论

细胞周期紊乱是肿瘤最主要的发生机制之一。结肠癌中也存在多种基因异常导致其细胞周期紊乱[2]。CDC6基因位于人类基因17q21.2，真核细胞中CDC6蛋白是ATP结合蛋白和复制前复合体(pre-replication complexes, pre-RC)成员，是细胞起始DNA复制的必需蛋白[2]；其主要功能是结合起始识别复合物(ORC)、CDT1和MCM复合体(含MCM2-7蛋白)，以ATP依赖的方式组装在ORC后，将MCM蛋白加载到DNA上，促进细胞从G1期进入S期[2-3]。除起始DNA复制外，CDC6还可抑制有丝分裂期细胞周期蛋白CDK1的活性，影响细胞分裂增殖，参与细胞恶性转化[3,6]。CDC6在正常组织细胞复制时，仅在G1期呈瞬时高表达；在肿瘤组织中却存在持续高表达，促进细胞周期转换，诱导细胞增殖。已有研究发现，CDC6在肝癌[5]、子宫颈癌[6]、乳腺癌[7]等多种恶性肿瘤中高表达。本实验发现CDC6在结肠正常组织中表达缺失；或在结肠隐窝底部呈散在核表达；在大部分结肠癌组织中呈细胞质和细胞核的高表达，可促进细胞持续G1/S期转换，进而导致结肠上皮恶性转化。

吕波等[5]报道CDC6的高表达可促进肿瘤转移，如肝癌的淋巴结转移患者其肿瘤组织中CDC6表达明显升高。Deng等[9]采用免疫组化法研究发现，与正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中CDC6蛋白水平升高，CDC6表达与FIGO分期、分化程度、腹水、腹水恶性肿瘤细胞及淋巴结状态显著相关。本实验结果显示，CDC6的高表达与结肠癌患者淋巴结转移数量、临床分期及远处转移密切相关；高表达CDC6患者生存期明显低于CDC6低表达患者，Cox回归分析提示，CDC6高表达是结肠癌预后的独立风险因素。

CDC6过表达能促进肿瘤增殖，有研究认为可能与CDC6高表达抑制癌细胞凋亡有关[9-11]。CDC6的过表达能通过调控BCR/ABL信号通路抑制慢性髓系白血病细胞凋亡[10]。Karanika等[11]研究认为CDC6过表达显著降低AR信号抑制剂Enzalutamide和Chk1/2抑制剂AZD7762诱导的细胞凋亡，在进展性前列腺癌中表达增加，通过抑制AR-CDC6-ATR-Chk1信号通路，能靶向前列腺癌的DNA损伤应答。在体外血清饥饿释放过程中卵巢癌细胞系HO8910细胞内CDC6、Cyclin D1和PCNA的表达上调，而p16的表达下调。此外，下调CDC6可降低细胞增殖和集落形成[9]；提示CDC6可作为恶性肿瘤潜在的治疗靶点。

CDC6在结肠癌中的作用报道较少，罗金现等[12]分别对结直肠癌显著差异的基因作GO富集、KEGG通路以及蛋白质相互作用网络分析，筛选出CDC6等多个与结直肠癌发生、发展关系密切的关键基因。应用TCGA数据库信息学分析CDC6在各肿瘤中的表达丰度，发现CDC6在结肠癌中表达明显高于正常组织，本实验结果证实CDC6在结肠癌组织中高表达，与结肠癌转移、分期及预后不良有关，然而其具体作用机制尚不明确，进一步深入分析将有助于阐明结肠癌发生、发展机制，为结肠癌治疗提供新的治疗靶点。