神经胶质瘤中NQO1高表达在预后评估中的意义

郑 兰，王馨悦，韩安娜，尹香琳，王艺璇，林贞花，杨 洋

神经胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，其发病率占颅内肿瘤总发病率的40%～50%，且具有发病隐匿、恶性度高等特点，多数患者就诊时已为疾病晚期。因此，亟待寻找神经胶质瘤的早期诊断及预后评估的有效分子靶标，以改善神经胶质瘤患者的预后。NQO1基因定位于16p22，长度为20 kb，含有6个外显子和5个内含子。它主要通过双电子还原反应使醌类化合物变成低毒性的氢醌类物质，从而使细胞免受氧化损伤[1-2]。研究显示，NQO1蛋白高表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，如甲状腺[3]、卵巢癌[4]和结肠癌[5]等。其中，Yang等[6]研究显示，NQO1蛋白高表达可作为乳腺癌评估的独立风险因素。目前，关于NQO1与神经胶质瘤的文献报道较少。因此，本文旨在应用免疫组化EnVision法检测NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中的表达，探讨NQO1表达水平在神经胶质瘤中的临床病理学意义及其与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料神经胶质瘤组织芯片购于上海芯超生物公司，包含122例神经胶质瘤组织，17例癌旁正常组织。所有患者临床、病理及实验室资料完整。病理类型和恶性程度按WHO(2018)胶质母细胞瘤的标准进行分类。

1.2 试剂NQO1鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司(sc-32793)；免疫组化EnVision法检测试剂盒购自DAKO产品。

1.3 方法免疫组化采用EnVision法染色。组织芯片行常规脱蜡、梯度乙醇水化，于柠檬酸盐抗原修复液中热修复，经PBS缓冲液清洗，加入l ∶200稀释的鼠抗NQO1抗体4 ℃冰箱孵育过夜，标记辣根过氧化物酶的抗鼠二抗室温下孵育45 min，DAB显色，苏木精对比染色，中性树胶封固。为了证明NQO1蛋白抗体免疫组化检测的特异性，实验中应用鼠IgG代替一抗作为对照，结果为阴性。同时，选择NQO1蛋白阳性染色切片，以PBS代替一抗染色结果为阴性。利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)在线分析TCGA数据库神经胶质瘤样本中NQO1 mRNA的表达，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

1.4 判断标准NQO1蛋白表达以细胞质呈棕褐色颗粒为阳性。根据细胞染色强度进行计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞数的百分比计分：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘：0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为()，9～12分为()。其中≤4分为低表达，>4分为高表达。以“-”为阴性，“+”为阳性，“～”为强阳性。

1.5 统计学分析应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，采用χ2检验或Fisher精确检验法，运用Kaplan-Meier生存分析。以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中的表达免疫组化染色结果显示NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中主要定位于细胞质，少量表达于细胞核。在122例神经胶质瘤组织中，NQO1蛋白的阳性率和强阳性率分别为88.5%(108/122)和52.5%(64/122)。在17例癌旁正常组织中，NQO1蛋白的阳性率和强阳性率分别为29.4%(5/17)和5.9%(1/17)。NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中的表达明显高于癌旁正常组织，且差异有显著性(P<0.01，表1，图1)。

图1A. NQO1蛋白在癌旁正常组织中呈阴性(-)，EnVision法；B. NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中呈弱阳性(+)，EnVision法；C.NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中呈强阳性，EnVision法()；D. NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中呈强阳性()，EnVision法

表1 癌旁正常组织和神经胶质瘤组织中NQO1蛋白的表达

与癌旁正常组织相比，**P<0.01

2.2 NQO1蛋白高表达与神经胶质瘤临床病理特征的关系进一步分析NQO1蛋白高表达与神经胶质瘤患者临床病理特征的关系，结果显示：NQO1蛋白高表达与神经胶质瘤患者性别、年龄、肿瘤大小、发生部位及浸润情况无关，与临床分期密切相关(P<0.05)。其中，NQO1蛋白在晚期(Ⅲ+Ⅳ)神经胶质瘤组织中的强阳性率(46/75，61.3%)明显高于早期(Ⅰ+Ⅱ)神经胶质瘤组织(18/47，38.3%)(P=0.013，表2)；提示NQO1蛋白可能参与神经胶质瘤的发生、发展。

表2 神经胶质瘤临床病理特征与NQO1高表达的关系[n(%)]

组间比较，*P<0.05

2.3 NQO1蛋白高表达与神经胶质瘤预后的关系TCGA数据库分析显示，在162例神经胶质瘤患者中，NQO1 mRNA高表达的神经胶质瘤患者的无瘤生存期明显低于NQO1 mRNA低表达者(P<0.05，图2)，但总生存期差异无显著性。

3 讨论

近年研究发现 NQO1 基因609位点可发生 C-T的突变，导致原来野生纯合CC基因型变成突变杂合CT或突变纯合TT基因型，致使该酶活性减弱或完全丧失，降低NQO1解毒及维护细胞稳定的功能，因而增加某些易感个体细胞发生癌变的可能性，使其具有促癌作用[7]。本组发现与癌旁正常组织相比，NQO1蛋白在神经胶质瘤组织中的阳性率明显升高，与NQO1在多种恶性肿瘤中高表达的报道一致[8-12]。NQO1蛋白高表达与神经胶质瘤患者的病理分级密切相关，但与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及有无浸润无相关性。以上结果均提示，NQO1蛋白高表达可能在神经胶质瘤的演进中发挥重要作用。Li等[13]认为NQO1是值得有效利用的肿瘤特异性标志物，其不受细胞周期及抑癌基因的影响和控制。因此，推测NQO1的持续异常激活可能在神经胶质瘤的发生、发展中起重要作用。

图2 TCGA数据库分析NQO1高表达的神经胶质瘤患者的预后：A.NQO1 mRNA表达水平与总生存期无关；B. NQO1 mRNA高表达的神经胶质瘤患者的无瘤生存期低于NQO1 mRNA低表达患者(P=0.044)

我们前期研究表明，NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌中呈高表达，是卵巢黏液性囊腺癌的独立风险因子[14]；NQO1蛋白对结直肠癌患者生存期有显著影响，可作为结直肠癌患者预后评估的分子标志物[5]。此外，在乳腺癌中NQO1蛋白高表达与患者不良预后显著相关[15]，且NQO1/PKLR轴激活可通过调节葡萄糖代谢重编程，促进乳腺癌细胞淋巴转移及肿瘤演进[8]，抑制NQO1表达可调节乳腺癌细胞增殖及EMT过程[15]。本实验通过TCGA数据库生存分析发现，NQO1 mRNA高表达的神经胶质瘤患者的无瘤生存期显著低于NQO1 mRNA低表达者，提示NQO1高表达可能是神经胶质瘤判断预后的有效标志物。

综上所述，NQO1在神经胶质瘤的演进过程中起重要作用，对于判断神经胶质瘤的进展及预后具有重要的指示意义。NQO1蛋白有望成为神经胶质瘤早期诊断、治疗和预后评估的生物学标志物。目前，NQO1在恶性肿瘤中高表达的具体机制尚不清楚，有待于进一步的分子生物学分析证实。