胃癌中HSDL2过表达与临床病理特征的相关性

董 兵，朴俊杰,2，杨 洋,2，朱 光，秦云植，林贞花,2

胃癌是我国第二大常见肿瘤[1]，其侵袭性强、恶性程度高，患者5年生存率仅为10%[2-3]。胃癌的发生、发展是一个长期的、多阶段、多因素共同参与的过程，如环境因素引起的幽门螺旋杆菌感染等[4]。随着蛋白组学和基因组学的飞速发展，血清CEA、CA19-9、CA72-4等大量生物学标志物的发现提高胃癌的早期诊断，但这些标志物仍存在特异性低和敏感性差等问题亟待解决[5-6]。

人类羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2, HSDL2)是短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族的成员之一[7]。HSDL2在人体组织中广泛表达，尤其在肝脏、肾脏及前列腺中的表达水平较高。研究显示，HSDL2异常表达与细胞的恶性转化密切相关，可参与乳腺癌、卵巢癌的发生、发展[8-9]，目前HSDL2在胃癌中的表达及作用尚未见报道。本文旨在探讨HSDL2蛋白在胃癌中的表达，并分析HSDL2过表达与胃癌临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2003年10月～2015年10月延边大学肿瘤研究中心存档的胃癌组织标本90例、正常胃组织标本20例(部分组织标本购自上海芯超公司)，患者临床病理资料均完整。所有组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。90例胃癌患者中男性65例，女性25例；年龄<50岁者19例，≥50岁者71例；肿瘤直径≤5.0 cm者55例，>5.0 cm者35例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移67例；高分化4例，中分化50例，低分化36例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期70例。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化SP两步法检测HSDL2蛋白的表达，HSDL2兔抗人多克隆抗体购自美国Proteintech公司(15631-1-AP)。染色步骤：组织4 μm厚连续切片，常规脱蜡，梯度乙醇水化，热柠檬酸盐缓冲液中抗原修复，滴加一抗HSDL2(稀释比1 ∶100)，4 ℃孵育过夜。次日辣根过氧化物酶标记二抗，DAB显色，Mayer苏木精复染，中性树胶封固。为证明HSDL2抗体免疫组化的特异性，选用HSDL2蛋白强阳性染色的切片，以PBS代替一抗作为阴性对照。采用UALCAN数据库分析胃癌及正常组织中HSDL2 mRNA的表达水平。

1.2.2免疫荧光 免疫荧光染色用于检测HSDL2在SGC-7901和AGS胃癌细胞中的定位。当SGC-7901、AGS细胞在盖玻片上生长融合至70%～80%时，经4%多聚甲醛固定。使用0.5%TritonX-100透化细胞后，3%牛血清白蛋白V(A8020，北京索莱宝公司)封闭。滴加一抗HSDL2(稀释比1 ∶100)，4 ℃孵育过夜。滴加Alexa Fluor 488孵育山羊抗兔IgG(H+C)(A11008，1 ∶1 000，Invitrogen公司)室温孵育1 h。PBS洗涤后，DAPI染色(C1006，上海碧云天生物公司)，盖玻片封固。IF信号可视化，并用BX53 Olympus显微镜记录。

1.3 结果判断根据Beesley分级法，HSDL2蛋白以细胞质呈棕褐色颗粒为阳性。根据细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞百分比计分：阳性细胞数占0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。将两项得分结果相乘：0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为()，9～12分为()；其中≤4分为HSDL2低表达，>4分为HSDL2高表达。

1.4 数据库分析通过UALCAN数据库分析HSDL2 mRNA表达水平，通过GEPIA数据库分析HSDL2表达与患者生存期的关系。

1.5 统计学分析所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。各组间阳性率差异的比较及与临床病理特征之间的关系采用χ2检验及P值修正。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSDL2蛋白在胃癌细胞SGC-7901和AGS中的表达为确定HSDL2的亚细胞定位，分别在SGC-7901和AGS胃癌细胞中进行HSDL2蛋白的免疫荧光检测。结果显示：HSDL2的强阳性信号主要定位于胃癌细胞SGC-7901和AGS的细胞质(图1)。

2.2 HSDL2在胃癌组织中的表达UALCAN数据库分析结果显示，胃癌组织中HSDL2 mRNA表达水平高于正常胃组织(P<0.05，图2)。为了进一步明确HSDL2蛋白在胃癌组织中的表达，分别对90例胃癌组织及20例正常胃组织进行免疫组化染色。结果显示：HSDL2蛋白在正常胃组织中低表达或不表达；在胃癌组织中过表达，且主要表达于细胞质(图3)。HSDL2蛋白在胃癌组织中的强阳性率为(58.9%，53/90)，高于正常胃组织(5.0%，1/20)，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 胃癌及正常胃组织HSDL2蛋白的表达

**P<0.01：胃癌组织阳性率vs正常胃组织的阳性率；##P<0.01：胃癌组织强阳性率vs正常胃组织的强阳性率

图1免疫荧光检测HSDL2蛋白在胃癌细胞SGC-7901和AGS中的定位

图2 UALCAN数据库分析HSDL2 mRNA表达水平

图3免疫组化检测HSDL2蛋白在胃癌组织中的表达，SP两步法：A.正常胃组织中HSDL2蛋白呈阴性；B.胃癌组织中HSDL2蛋白呈弱阳性；C.胃癌组织中HSDL2蛋白呈阳性；D.胃癌组织中HSDL2蛋白呈强阳性，染色定位于细胞质并有核周聚集现象

2.3 HSDL2蛋白过表达与胃癌临床病理特征的关系为探讨HSDL2过表达在胃癌恶性演进过程中的作用，本实验分析HSDL2蛋白过表达与胃癌患者临床病理特征的关系。结果发现：HSDL2过表达与胃癌分化程度、临床分期及肿瘤直径密切相关，与患者性别、年龄及有无淋巴结转移无明显相关性。其中，HSDL2在低分化组织中的强阳性率(91.7%)明显高于高分化组织(0)和中分化组织(46.0%，P<0.01)，HE染色结果与之一致(图4)；HSDL2在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)胃癌组织中的强阳性率(72.9%)高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)胃癌组织(20.0%，P<0.01)；HSDL2在胃癌肿瘤直径>5.0 cm组织中的强阳性率(68.6%)高于肿瘤直径≤5.0 cm组织(54.5%，P<0.05，表2)。上述结果提示HSDL2蛋白可能参与胃癌的发生、发展，对判断胃癌的进展有重要的临床价值。

表2 胃癌临床病理特征与HSDL2蛋白过表达的相关性[n(%)]

*P<0.05，**P<0.01

2.4 HSDL2蛋白过表达与胃癌患者预后的关系本实验经GEPIA数据库统计分析发现，HSDL2蛋白过表达的胃癌患者无瘤生存期(图5A)低于HSDL2蛋白低表达者(P<0.05)，但两组总生存期差异无统计学意义(图5B)；提示HSDL2蛋白表达水平可能对胃癌患者的预后评估具有重要意义。

3 讨论

HSDL2最早分离、鉴别于人胎脑组织的cDNA文库，其cDNA全长3 211 bp，定位于9号染色体长臂的32区[10]。HSDL2蛋白由418个氨基酸构成，包含N末端SDR结构域、C末端甾醇载体蛋白2(sterol carrier protein 2, SCP2)结构域和过氧化物酶体靶向信号(ARL)，可催化多种底物(如类固醇和脂肪酸等)氧化还原反应[11]，其中过氧化物酶体是脂质代谢的核心，可通过结合类固醇脱氢酶其他亚族促进胆固醇代谢及甾体激素的合成[12]。Gallegos等[13]发现HSDL2过表达可加快细胞内胆固醇的合成，提高体内总胆固醇的含量；对小鼠进行高胆固醇喂食后，其体内HSDL2蛋白的表达量也明显升高，提示HSDL2蛋白可能参与胆固醇代谢的信号传导并控制其合成。Kowalik等[7]报道HSDL2蛋白在人类、大鼠和小鼠的过氧化物酶体和线粒体中发挥重要作用，并可能与脂肪酸代谢相关，参与脂质代谢，而脂质代谢异常是癌症的主要标志之一，提示HSDL2蛋白可能与一些肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示HSDL2在乳腺癌组织中异常高表达，且沉默HSDL2可以抑制乳腺癌细胞的增殖能力[8]。值得注意的是，Zhang等[14]通过慢病毒转染构建胆管癌HSDL2过表达的稳转细胞株，发现HSDL2过表达可以抑制胆管癌细胞的增殖能力并促进细胞凋亡；提示HSDL2蛋白是一把双刃剑，在不同癌症中发挥不同作用。目前，HSDL2蛋白在胃癌中的表达尚未见报道。

图4免疫组化检测HSDL2蛋白在低、中、高分化胃癌组织中的表达；HE染色观察低、中、高分化胃癌组织形态学之间的差异

图5 GEPIA数据库分析HSDL2表达与患者生存期的关系：A.无瘤生存期；B.总生存期

本实验运用UALCAN数据库分析发现，胃癌组织中HSDL2 mRNA表达水平高于正常胃组织，与本组实验结果相符。本实验发现HSDL2蛋白表达主要定位于胃癌细胞胞质，且在胃癌组织中过表达，强阳性率(58.9%)高于正常胃组织(5.0%)。进一步分析发现，HSDL2过表达与胃癌分化程度(P=0.01)、临床分期(P=0.07)及肿瘤直径(P=0.017)密切相关；提示随着胃癌的发生、发展，HSDL2蛋白的表达也呈逐渐升高的趋势，这与Zeng等[15]在甲状腺乳头状癌中HSDL2表达的结果一致。以上研究结果均提示HSDL2蛋白在肿瘤的发生、发展中，可能发挥重要作用。

本实验通过GEPIA数据库分析发现HSDL2过表达的胃癌患者无瘤生存期低于HSDL2低表达患者(P<0.05)，但两组的总生存期差异无统计学意义，与Sun等[9]在卵巢癌中的研究结果相符。其总生存期差异无统计学意义，可能与数据库样本数有关。以上结果提示HSDL2蛋白过表达，可能是胃癌患者预后评估的重要分子标志物之一。

综上所述，HSDL2蛋白可能参与胃癌的恶性演进过程，对判断胃癌的进展及预后具有重要的临床价值。目前，HSDL2在胃癌中过表达的机制尚不清楚。因此深入分析肿瘤发生、发展中的作用及具体分子机制，为胃癌的靶向治疗提供可靠、有效的理论与实验依据。