对香豆酸对慢性束缚应激诱导小鼠抑郁样行为的作用*

肖楚丽， 滕 林， 李金成， 肖煦晖， 于旭东

((邵阳学院基础医学院， 湖南 邵阳422000)

抑郁症是一种常见的神经精神疾病，其症状表现为兴趣丧失，睡眠障碍，无助感增加，自信心低下，甚至是自杀倾向。根据世界卫生组织的估计，2015年抑郁症患者约占全球人口的4.4%，而抑郁症的总数在2005年至2015年期间增长了18.4%。抑郁症已成为我国人口死亡的第十大原因和第二大致残因素[1,2]。虽然作用于“单胺能”的抗抑郁药物在临床上广泛应用,然而，由于抑郁症的复杂性和异质性，大量抑郁症患者仍无药可治[3]。

对香豆酸(p-Coumaric acid，p-CA)是一种衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，广泛分布于许多植物和人类饮食中，如谷物，水果和蔬菜，具有多种药用活性，包括抗氧化，心脏保护，抗疟原虫，抗突变，抗血小板，抗炎症和免疫调节作用[4-6]。在中枢神经系统中，研究表明p-CA可改善脑缺血/再灌注损伤,改善东莨菪碱诱导的记忆障碍[7,8]。然而p-CA在抑郁症中的作用却研究滞缓，尤其是在应激性抑郁行为的作用并无报道。

原肌球蛋白激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)受体为脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的受体，可通过其下游信号级联影响基因表达，神经递质释放，突触蛋白运输来调节神经发育和突触可塑性，进而参与抑郁症的发生发展[9]。TrkB受体拮抗剂ANA-12，可选择性与TrkB受体结合，抑制TrkB下游通路，可阻断多种药物的抗抑郁样作用[10]。p-CA可上调BDNF[11]，然而p-CA和TrkB关系未见报道。本文拟基于慢性束缚应激(chronic restraint stress, CRS)诱导的小鼠抑郁模型探索p-CA在强迫游泳测试和悬尾测试中的抗抑郁作用，此外，我们应用TrkB受体拮抗剂ANA-12观察其对p-CA抗抑郁样作用的影响，以期明确TrkB受体是否介导了p-CA的这种作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性ICR小鼠(雄性，体重30～35 g，许可证号：SCXK湘2019-0004)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。2只每笼，均饲养于标准实验动物环境(环境温度：(23±2)℃；光照周期：12 h/12 h)中，并保证小鼠可自由摄食和饮水。所有ICR小鼠在实验处理之前饲养一周，以适应新环境。所有实验程序均完全按照美国国家卫生研究院关于和使用实验室动物的指南进行。

1.2 试剂

p-CA(阿拉丁，上海)分散于10%的吐温80中，剂量为100 mg/kg[11]；ANA-12(selleck)分散于1% DMSO中，剂量为0.5 mg/kg；以上药物均经腹腔注射，药物及溶媒的注射体积为10 ml/kg。

1.3 实验设计及流程

1.3.1 实验1 p-CA对CRS诱导小鼠抑郁样行为的影响。小鼠随机分成对照组(Control)，慢性束缚应激组(CRS)和慢性束缚应激+p-CA组(CRS+p-CA)，每组8只，其中慢性束缚应激小鼠每天接受4 h的束缚应激，连续束缚21 d，而对照组小鼠留在笼中不被打扰。第22日小鼠腹腔注射溶媒(10%吐温80)或p-CA(100 mg/kg)，注射后1 h进行自发活动测试(locomotor activity test, LMA)，注射后4 h强迫游泳测试(forced swimming test, FST)，注射后24 h进行悬尾测试。观察小鼠在行为测试中的表现。

1.3.2 实验2 ANA-12对p-CA改善CRS应激小鼠抑郁行为的影响。小鼠随机分成慢性束缚应激组(CRS) ，慢性束缚应激+ANA-12组(CRS+ANA-12)和慢性束缚应激+p-CA组(CRS+ p-CA)慢性束缚应激+p-CA +ANA-12组(CRS+ p-CA +ANA-12)，每组8只，4组小鼠每天接受4 h的束缚应激，连续束缚21 d。第22日小鼠腹腔注射溶媒(10%吐温80)或p-CA(100 mg/kg)，ANA-12在p-CA注射前30 min给药。注射后1 h进行LMA，注射后2 h进行强迫游泳测试(FST)，注射后24 h进行悬尾测试(tail suspension test, TST)。分别观察小鼠在各行为测试中的表现。

1.4 慢性束缚应激(CRS)

小鼠束缚在50 ml的透明塑料管内进行，塑料管均匀分布直径为4 mm的透气孔并放置于鼠笼附近。每天上午10:00将小鼠放入塑料管内，并使其保持头部朝上，每天束缚4 h，连续束缚21 d。

1.5 自发活动测试(LMA)

自发活动测试在昏暗的隔音箱(长60 cm，宽40 cm，高50 cm)中进行，将小鼠轻轻地放入隔音箱中10 min，通过行为分析软件Anymaze 6.10统计小鼠10 min的活动距离。每次测试前，使用75%的乙醇溶液清洁隔音箱底部。

1.6 悬尾测试(TST)

距离小鼠尾尖约1 cm处使用胶带将鼠尾固定于绳上并悬挂在离地面50 cm的隔音箱箱顶。测试持续6 min，记录并分析后4 min内小鼠的不动时间。

1.7 强迫游泳测试(FST)

将小鼠置于装有水的透明玻璃桶中(直径：15 cm，高度：20 cm)，放入水温(25±1)℃的水至15 cm高。每只小鼠被迫游泳6 min并在测试结束后换水，记录测试中最后4 min的不动时间。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 p-CA改善CRS诱导小鼠抑郁样行为的作用

实验结果显示(表1)：在FST中，与Control组相比，CRS明显增加小鼠不动时间(P<0.05)，而p-CA明显减少CRS诱导的小鼠不动时间增加(P<0.05)。在TST中，与Control组相比，CRS明显增加小鼠不动时间(P<0.05)，而p-CA明显减少CRS诱导的小鼠不动时间增加(P<0.01)。在LMA中，各种处理均不影响小鼠的活动距离(P>0.05)。这些结果表明， p-CA改善 CRS诱导小鼠FST和TST中的抑郁样行为。

Tab. 1 Effects of p-CA on depression-like behaviors induced by CRS in mice n=8)

2.2 ANA-12阻断p-CA 改善CRS小鼠抑郁样行为的作用

实验结果显示(表2)：在FST中，与CRS组相比，CRS+ p-CA组小鼠不动时间明显减少(P<0.05)，而与CRS+ p-CA组相比，CRS+ ANA-12+ p-CA组小鼠不动时间显著性增多(P<0.05)。在TST中，与CRS组相比，CRS+ p-CA组小鼠不动时间明显减少(P<0.05)，而与CRS+ p-CA组相比，CRS+ ANA-12+ p-CA组小鼠不动时间显著性增多(P<0.01)。在LMA中，各种处理均不影响小鼠的活动距离(P>0.05)。这些结果表明，ANA-12阻断p-CA对 CRS小鼠FST和TST中抑郁样行为的改善作用。

Tab. 2 Effects of ANA-12 on p-CA improved depression-like behaviors in CRS mice n=8)

3 讨论

与急性应激相比，慢性应激诱导的抑郁模型和人类抑郁症发病更加接近，不同的慢性应激模型在模拟不同的抑郁类型上各有侧重。如慢性社会挫败抑郁模型主要模拟由社会攻击所造成的抑郁症，慢性不可预测应激主要模拟不同应激性生活事件引起的抑郁症，而慢性束缚应激则主要模拟相同的重复的应激事件所造成的抑郁症[12]。慢性束缚应激作为慢性应激的一种，与慢性不可预测应激和慢性社会挫败应激相比具有操作简单、工具易得、成模率高、可重复性强的优点，如今已作为一种经典的啮齿类抑郁模型被广泛应用[13]。FST及TST是初步评价啮齿类的抑郁样行为的常用模型，也是其他抑郁模型中评估动物抑郁样水平的常用测试方法。啮齿类在强迫游泳测试中和悬尾测试中试图逃脱，多次失败后出现的不动行为被视为“绝望”，这与抑郁症病人的主要症状相似[13]。

之前证据表明慢性不可预测应激、慢性社会挫败等抑郁模型中，小鼠在强迫游泳和悬尾测试中均表现出抑郁样行为[14]。确实，当前研究发现小鼠经历21 d束缚应激后在强迫游泳和悬尾测试中不动时间增加。此外，由于动物FST和TST中的不动时间受其活动水平的影响。因此，常进行自发活动测试排除活动水平对其潜在的影响[15]。结果显示，慢性束缚应激不影响自发活动测试中小鼠的活动水平，这些证据表明慢性束缚应激诱导小鼠抑郁样行为,进一步支持了应激对小鼠抑郁样行为的影响。

P-CA在中枢疾病中发挥广泛的神经保护作用[6-8]。P-CA可改善小鼠氧化应激及脑缺血/再灌注损伤，东莨菪碱诱导大鼠被动回避和水迷宫测试中记忆障碍[7,8]。重要的是，P-CA可改善炎性抑郁大鼠强迫游泳及悬尾测试中的抑郁样行为[11]。一致的是，当前研究结果显示p-CA一次给药后4 h明显减少CRS诱导的小鼠FST不动时间增加。并且给药后24 h仍可明显减少CRS诱导的小鼠TST不动时间增加。此外， p-CA不影响小鼠的自发活动测试中的活动水平，表明p-CA不是通过增加小鼠活动水平来减少小鼠不动时间的。这些结果拓展了p-CA的神经保护作用并进一步支持了p-CA的抗抑郁样作用。

目前亟需快速的抗抑郁作用药物，即药物在注射后几小时内起效[16]。如，潜在的快速抗抑郁药物氯胺酮、越鞠醇提物等均可在给药后2 h内改善小鼠的抑郁样行为[17]。p-CA给药后4 h显著性降低小鼠FST中不动时间，并且，p-CA具有吸收快，生物利用度高的特点[18]，提示其可能具有快速的抗抑郁样作用。

TrkB受体通过调节激活多种下游信号分子MAPK / ERK，PI3K和PLCγ信号级联从而影响基因表达，神经递质释放，突触蛋白运输并且在抑郁症发生发展中发挥重要作用[19]。在慢性温和应激、慢性社会挫败等抑郁模型中均观察到脑中TrkB受体活性降低[20]。一些抗抑郁药物可激活TrkB受体。并且TrkB受体拮抗剂阻断药物的抗抑郁作用[21]。一致的是，TrkB受体拮抗剂ANA-12单独给药不影响慢性应激小鼠抑郁样行为[21]。而ANA-12预处理阻断p-CA对应激性诱导抑郁样行为的改善作用。这些结果表明p-CA促应激性学习记忆可能依赖于TrKB，进一步支持TrKB信号在抑郁症中的作用。然而本研究仍缺乏生化指标，在将来的研究中应进一步检测p-CA对TrKB和TrKB磷酸化水平的影响。

本研究基于慢性束缚应激抑郁模型，运用FST、TST等测试方法，观察到p-CA可改善应激诱导小鼠抑郁样行为，其作用可能依赖于TrKB受体；为进一步明确p-CA抗抑郁的普遍性，在今后的研究中还应运用慢性社会挫败抑郁模型等进一步评价p-CA的抗抑郁作用。