右归丸对大鼠膝骨关节炎的干预作用及其机制*

颜春鲁， 安方玉， 汪永锋， 金 华， 赵崇博， 王统香， 邓 婕， 张蕾蕾

((1. 甘肃中医药大学中西医结合学院， 2. 教学实验实训中心， 3. 基础医学院， 4. 中医临床学院， 5. 临床医学院， 甘肃 兰州730000； 6. 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室， 甘肃 兰州 730000； 7. 敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室， 甘肃 兰州 730000； 8. 兰州市疾病预防控制中心， 甘肃 兰州 730000)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是以膝关节软骨变性、丢失、膝关节边缘软骨和软骨下骨病变为主的一种慢性退行性关节疾病，临床表现以膝关节疼痛和活动障碍为主[1]。研究调查发现[2]，在超过55 岁的中老群体中，KOA的发病率约达到44%～70%。近年来，随着社会老龄化人口的增加，其发病率也显著上升，成为危害着中老年人健康的重要隐患，给家庭和社会带来沉重的经济负担，引起全社会的极大关注。目前 KOA 的治疗仍然以西医治疗为主，但是西药毒副作用较大、且无法从根本上解决关节软骨退变问题。近年来，中药则以低毒、安全、高效的优势广泛用于治疗KOA，其对KOA的治疗机制研究备受关注。有研究证实，补肾活血方通过减少炎症因子的产生来保护关节软骨组织，对治疗KOA确实有效[3]。本课题组前期研究也发现[4]，补肾中药右归丸也可以通过减少KOA模型鼠炎症因子和基质金属蛋白酶的产生来对关节软骨组织损伤发挥治疗作用。但是，右归丸除了抑制炎症因子和基质金属蛋白酶的产生外，是否还可以通过调节其他一些蛋白的表达来发挥治疗作用，这些蛋白通过什么分子机制发挥作用尚不十分清楚。为此，本研究以SD作为研究对象，采用Hulth法建立KOA 大鼠模型，给予右归丸干预，检测大鼠软骨组织骨诱导因子(osteoglycin，OGN)、骨黏连蛋白(osteonectin，ON)、纤维蛋白原2(fibrinogen 2，FBN2)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)蛋白表达变化，探讨右归丸治疗 KOA 的效应及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重(180±20)g，购自我校科研实验动物饲养中心。动物质量合格证号：SYXK(甘)2015-0005。

1.2 主要试剂

水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20150105)；GAPDH抗体(Immuno Way，批号：B4501)； Rabit Anti-OGN Polyclonal Antibody(Bioss，批号：AD04145689)；Rabit Anti-ON Polyclonal Antibody(Bioss，批号：AB10115689)；Rabit Anti-FBN2 Polyclonal Antibody(Bioss，批号：AG09111831)；Rabit Anti-GSK-3β Polyclonal Antibody(Immuno Way，批号：B1801)。

1.3 主要仪器

BioMATE 3S型蛋白、核酸浓度测定仪(Thermo公司)； BX53型显微镜(日本OLYMPUS公司)；ChemiDocTMXRS+型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；TGL16M型台式高速冷冻离心机(凯达集团成员高科技公司)；OSE-Y10型电动组织研磨器(上海Tiangen 公司)。

1.4 实验药物及给药剂量

右归丸(仲景宛西制药股份有限公司，国药准字Z41022170，批号：151108)，人的临床用量为：27 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法：27 g×0.018×5≈2.4 g/kg，作为中剂量。则右归丸高、中、低剂量分别为4.8、2.4、1.2 g/kg；硫酸氨基葡萄糖片(保节力，新兴同仁药业有限公司，国药准字H20041317，批号：160302)；青霉素(北制药股份有限公司，国药准字：H13020657，批号：F6042103)。

1.5 动物分组、造模及给药

60只 SD 大鼠适应性饲养 1 周后，随机分为6组，分别为假手术组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组、右归丸高、中、低剂量组，每组10只。 模型组及干预组采用改良Hulth 方法复制KOA模型[5-6]。假手术组 SD 大鼠从膝关节内侧只打开关节腔，不破坏韧带和半月板，并保留关节软骨面。术后给予青霉素(20万 U/d)肌肉注射，连续3 d。各组大鼠自由饮水，摄食6 周后，HE染色观察软骨细胞的形态变化以判定模型制备是否成功，造模成功后药物组给予相应药物干预，硫酸氨基葡萄糖组灌服硫酸氨基葡萄糖(0.17 g/kg)，右归丸高、中、低剂量组分别按 4.8、2.4、1.2 g/kg灌服相应的药物，干预 8周。股动脉采血处死各组动物，摘取双侧膝关节，左侧膝关节固定于4%多聚甲醛，右侧膝关节于-80℃冰箱保存备用。

1.6 HE染色观察软骨形态学变化

采用保留股骨远端1/4和胫骨端近端1/4的方法留取完整膝关节，4%多聚甲醛固定左侧膝关节24 h后10% EDTA-Na2脱钙8周，石蜡包埋制作蜡块、切片HE 染色观察软骨病理形态学变化并进行 Mankin 评分方法[7]进行评分。评分标准为：软骨结构如常，软骨细胞数量如常，基质染色正常，潮线比较完整记为0 分；软骨表面有不规则裂隙，软骨细胞数量弥漫性增多，基质染色减退，出现多重潮线记为1 分；软骨裂隙深达肌层，软骨细胞成簇生长，基质染色明显减退，软骨下血管浸入肌层记为2分；软骨裂隙深达辐射层，软骨细胞数量明显减少，基质染色明显减退记为3 分；软骨裂隙深达钙化层，基质染色完全消失记为4 分；软骨层脱落记为5 分。

1.7 免疫组化法观察软骨组织OGN、ON和FBN2的蛋白表达

4%多聚甲醛固定膝关节软骨并脱钙，将石蜡切片进行脱蜡、脱水后放在切片放入配制好的枸橼酸缓冲液盒中进行微波修复；3%H2O2室温孵育30 min； 5%山羊血清封闭 30 min；滴加50 μl 的OGN、ON和FBN2 Polyclonal Antibody(一抗的稀释浓度分别为： 1∶100、1∶200、1∶100)，同时用PBS 缓冲液代替一抗设立阴性对照，将切片放入湿盒中，4℃过夜；滴加山羊抗兔的二抗，室温下放置30 min；滴加ABC工作液，37℃孵育60 min；DAB显色；苏木精复染；二甲苯透明，封固。染色以软骨基质表层和中层的软骨细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色，由我校病理教研室老师采用双盲法进行阅片。应用美国 Image-Pro Plus 6.0 全自动图像分析系统对软骨细胞阳性染色的积分光密度( integral optical density，IOD) 进行定量分析，对进行标记，以其中一个具有代表意义阳性结果的视野的棕黄色颗粒为标准自动检测所有视野的阳性结果。鉴于经费的限制，加上大鼠动物数量6只及以上具有统计学意义，因此本实验在免疫组化的分析中每组采用的动物数量均是6只。

1.8 Western blot法测定软骨组织GSK-3β的蛋白表达

软骨组织蛋白质的提取用 RIPA 裂解液，蛋白质含量的测定用BCA 法，并调整点样的蛋白质浓度为50 μg /10 μl，10 μl/well，作SDS-PAGE、转膜、封闭、滴加抗Rabit Anti-GSK-3β Polyclonal Antibody一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后滴加山羊抗兔IgG二抗孵育，室温 孵育2 h，ECL超敏发光液显色曝光。应用美国 Image J分析软件以GAPDH抗体作为内参进行灰度值分析。鉴于经费的限制，加上大鼠动物数量6只及以上具有统计学意义，因此本实验在Western blot的分析中每组采用的动物数量均是6只。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 右归丸对大鼠膝关节软骨组织形态学影响

HE染色结果显示：假手术组大鼠关节面及滑膜结构完整，软骨细胞呈水平排列，关节软骨边缘光滑；模型组大鼠关节软骨边缘严重破坏，软骨细胞排列紊乱；右归丸低、中剂量组关节软骨边缘不平整，软骨细胞排列紊乱； 右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠软骨结构趋于正常，软骨细胞分布偶见不均，关节软骨表面欠光滑。Mankin评分结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠Mankin评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠Mankin评分均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与硫酸氨基葡萄糖组比较，右归丸低、中剂量组大鼠Mankin评分均显著升高(P< 0.05或P<0.01，表1，图1)。

Fig. 1 The pathomorphological changes of articular cartilages(HE ×200)

2.2 右归丸对大鼠软骨组织OGN、ON和FBN2蛋白表达的影响

染色以软骨基质表层和中层的软骨细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。假手术组 OGN和ON均呈阳性表达，FBN2呈弱阳性表达。模型组关节软骨中OGN和ON均几乎无表达，FBN2强阳性表达。右归丸中、高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组OGN和ON呈阳性和强阳性表达，右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组FBN2弱阳性表达。与假手术组比较，模型组大鼠OGN和ON蛋白表达IOD值显著降低，FBN2蛋白表达IOD值显著升高(P<0.01)；与模型组比较，右归丸中、高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组OGN和ON蛋白表达IOD值均显著升高，而右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组FBN2蛋白表达IOD值显著降低(P<0.05或P<0.01)；与硫酸氨基葡萄糖组比较，右归丸低剂量组OGN蛋白表达IOD值明显降低，低、中剂量组ON蛋白表达IOD值也均明显降低，而右归丸低、中剂量组FBN2蛋白表达IOD值均明显升高(P<0.05或P<0.01，表2，图2-4)。

Tab. 1 Comparison of Mankin scores in each n=10)

Tab. 2 IOD value comparison of the protein expressions of OGN, ON and FBN2 in each n=6)

Fig. 2 OGN protein expression of articular cartilage tissue in each group(IHC ×200)

Fig. 3 ON protein expression of articular cartilage tissue in each group(IHC ×200)

Fig. 4 FBN2 protein expression of articular cartilage tissue in each group(IHC ×200)

2.3 右归丸对大鼠软骨组织GSK-3β蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织GSK-3β蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖干预组GSK-3β的蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)；与硫酸氨基葡萄糖组比较，右归丸低、中剂量组GSK-3β的蛋白表达均显著降低(P<0.05或P<0.01，表3，图5)。

3 讨论

右归丸出自《景岳全书》，方药组成为：熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、附子、肉桂、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归。方中附子、肉桂、鹿角胶为君药，具有培补肾中元阳，温里祛寒之功效；熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药为臣药，具有滋阴益肾，养肝补脾，填精补髓之功效。菟丝子、杜仲为佐药，兼具补肝肾，强腰膝之功效，再配以当归养血和血，共补肝肾精血。诸药合用，以温肾阳为主而阴阳兼顾，肝脾肾并补，以在阴中求阳为其特点，使元阳得以归原。KOA的中医病机特点“肝肾亏虚为本，气滞、血瘀、痰湿凝聚为标”，并已有研究发现，补肾活血中药可显著改善 KOA大鼠的膝关节肿胀、软骨形态和软骨退变，说明补肾活血中药治疗 KOA可能有效[8]。此外，作为补肾的经典方药右归丸近年来也逐渐应用于临床膝骨关节炎患者的治疗，并主要用于治疗阳虚寒凝型膝骨关节炎患者，能够有效改善患者的炎症症状和缓解疼痛，增强患者的免疫力[9-10]。 本实验结果表明，假手术组大鼠关节面及滑膜结构完整，软骨细胞呈水平排列，关节软骨边缘光滑；模型组大鼠关节软骨边缘严重破坏，软骨细胞排列紊乱；给予右归丸干预后，右归丸低、中剂量组关节软骨边缘不平整，软骨细胞排列紊乱； 右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠软骨结构趋于正常，软骨细胞分布偶见不均，关节软骨表面欠光滑。说明右归丸治疗KOA有效，但具体机制不明。

Tab. 3 Effect of Youguiwan on the protein expressions of GSK-3β in KOA n=6)

Fig. 5 GSK-3β protein expressions of cartilaginous tissue in each group

骨诱导因子(osteoglycin，OGN)是一种属于富含亮氨酸小分子蛋白多糖基因家族(small leucine-rich proteoglycan，SLRP)成员的细胞外基质分子蛋白。研究表明[11-14]，OGN参与胶原纤维的形成和细胞的生长分化。叶青青等人[15]的研究发现，OGN的过度表达上调成骨相关标志物ALP的表达，并且下调脂肪细胞特异性标记物aP2的表达和破骨细胞分化因子RANKL基因的表达，以促进mMSCs成骨分化和抑制破骨细胞的作用。另有研究也发现，OGN可阻断OA患者的分解代谢途径和促血管生成途径[16]，也参与KOA软骨组织的重构[17-18]。可见，OGN对成骨细胞的形成和破骨细胞的分化起到重要的调节作用。骨粘连蛋白(osteonectin，ON) 是另外一种与Ⅰ型胶原形成非可溶性复合物，具有促进骨的钙化、骨形成和骨重建的细胞外基质非胶原蛋白的作用。研究发现，骨组织中的骨粘连蛋可通过调节成骨细胞与破骨细胞来促进骨的生长[19]。纤维蛋白原2(fibrinogen 2 ，FBN2)是一种参与凝血反应的蛋白质，迄今为止，在KOA中的作用鲜见报道。本实验结果表明，模型组大鼠软骨组织OGN、ON的蛋白表达明显降低，FBN2的蛋白表达明显升高；给予右归丸干预后，其KOA模型鼠软骨组织OGN、ON的蛋白表达明显升高，FBN2的蛋白表达明显降低。说明右归丸可能通过促进骨形成和骨重构来延缓KOA模型鼠的关节软骨退变，对KOA具有保护作用。而KOA模型鼠是否存在凝血功能异常及右归丸对KOA模型鼠的凝血功能是否存在调控作用，单凭FBN2的蛋白表达尚不能解释，尚需要通过其他凝血因子的检测来深入研究。

糖原合成酶激酶--3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是胞液中抑制Wnt信号通路异常激活的关键调控蛋白。Wu等[20]在用IL-1β诱导的兔关节退变软骨细胞中发现，Wnt1 和 β-catenin 的表达是增高的， GSK-3β 表达水平是降低的。Zheng等[21]的研究发现，用补骨脂提取物Psoralen(PSO)干预正常SD大鼠软骨细胞， PSO能诱导软骨细胞Wnt-4和β-catenin等蛋白的表达，抑制了GSK-3β的蛋白表达；而Litherland等[22]在KOA模型鼠和IL-β诱导的退变软骨细胞中发现，用GSK-3β抑制剂治疗的模型鼠与假手术比较，软骨破坏严重，并在软骨组织中出现了胶原蛋白的高表达；本研究结果显示，KOA模型鼠GSK -3β的蛋白表达是降低的，而右归丸治疗组GSK-3β的蛋白表达是升高的，与上述研究结果一致。说明右归丸可能通过增强GSK-3β的表达来抑制Wnt信号通路，从而发挥治疗作用。但是GSK-3β在KOA发病机制中的哪个环节发挥重要作用的问题，还需要进一步深入研究。

以往膝骨关节炎的研究主要集中于炎症反应及凋亡调控等机制的研究[23-24]，本研究结果则从影响膝骨关节炎模型鼠骨形成和骨分化的调控蛋白OGN和ON的表达变化初步揭示了右归丸治疗KOA的机制，其可能机制是通过促进OGN和ON的蛋白表达来促进KOA模型鼠的骨形成和骨重建，以及抑制GSK-3β的蛋白表达来抑制Wnt信号通路的激活，从而延缓关节软骨组织的退变。动态检测KOA患者OGN和ON的表达水平也可能成为未来中药复方治疗KOA疗效靶点的筛选依据。