消痰化瘀利窍中药组方对改善慢性间歇性低氧大鼠心肌纤维化的作用及其机制*

李杰茹， 任 静， 杨胜昌， 韩聚强， 郭亚净， 吉恩生

((河北中医学院生理教研室， 石家庄 050020)

心肌纤维化是以间质成纤维细胞增生，以Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)为特征的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，是许多心血管病变进展到特定阶段的共同表现[1，2]。近年来临床和动物实验发现，阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea, OSA)引起的慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)亦可诱发心肌纤维化，是心肌纤维化的危险因素[3-5]。OSA是一种睡眠状态下反复出现呼吸暂停，是以患者血液中长期CIH为主要病理改变的呼吸障碍性疾病。OSA在现代中医学被称为“鼾眠病”， 是由痰湿、血瘀、气虚所致，其涉及到的脏腑病变主要是肺、脾胃、肾[6]。消痰化瘀利窍中药组方是在临床实践中针对OSA患者脾虚失运、肺气失宣、痰阻血瘀的脏腑病变，以及疾病成因总结出的经验组方，可有效缓解鼾症，改善患者白天嗜睡、头疼、血压高、醒后乏力等临床症状。前期研究证实，消痰化瘀利窍中药组方具有抑制CIH大鼠心肌纤维化的作用，但具体作用机制尚不明确[7]。研究表明，TGF-β1是导致心肌纤维化最重要的因子之一[8]。因此，本研究利用CIH大鼠模型，模拟OSA病人缺氧复氧环境，观察该中药组方对改善慢性间歇性低氧性心肌纤维化的作用，并从TGF-β信号通路来探讨其可能机制。为该中药组方在临床上应用于改善OSA引发的心肌纤维化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 中药消痰化瘀利窍组方的配制

生药成分由丹参30 g、法半夏12 g、陈皮10 g、茯苓15 g、生黄芪 15 g、炒白术12 g、石菖蒲12 g、郁金12 g、射干12 g、 白芥子10 g、桔梗12 g、枳壳15 g、川芎12 g、赤芍15 g、地龙12 g 组成，以水煮醇沉法制备成含生药浓度为2.4 g/ml的汤剂。组方中的中药材购买于神威药业集团有限公司。

1.2 实验动物

40只清洁级雄性SD大鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重( 240±20) g，动物许可证号: SCXK [京]2016-0006。

1.3 试剂

兔抗鼠TGF-β抗体、兔抗鼠Smad2抗体、兔抗鼠Smad3抗体、兔抗鼠collagenⅠ抗体、兔抗鼠collagen Ⅲ抗体及兔抗鼠Tublin单克隆抗体均购于武汉赛维尔生物科技有限公司；天狼星红染色染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.4 实验分组及处理

新购的SD大鼠，在实验室适应喂养一周后，选取40只，按简单随机法随机分为4 组: 常氧组(Normoxia)、常氧+中药干预组(Traditional Chinese medicine Compound，TCMC)、CIH模型组(CIH)、CIH模型+中药干预组(TCMC+CIH)。遵循大鼠昼伏夜出的生活习性，在白天大鼠睡眠时间进行CIH造模，CIH组和TCMC+CIH组的大鼠舱内氧体积分数在90 s内从21%下降到9%，随后90 s再充氧后逐渐上升到21%。暴露周期每180 s重复一次，每天8 h(9:00-17:00)，持续3周[9]。此外，消痰化瘀利窍中药组方的中草药经“水煮醇沉法”制备完毕后，以每日24 g/kg的剂量(依据中药药理研究方法学的大鼠与临床药物剂量匹配值，计算该药物在实验动物体的有效剂量)给予TCMC+CIH 与TCMC两组的大鼠灌胃服用，此外CIH与Normoxia 两组大鼠在同一时段被灌服等体积生理盐水。21 d后，四组实验大鼠禁食12 h。次日上午用戊巴比妥(100 mg /kg, i.p.i.)依次麻醉各组实验大鼠，开胸取出心脏用PBS液灌流后，切取左心室为取材样品，将所得的左心室分为两部分，一部分置于4%的多聚甲醛液中固定，备用于天狼星红染色，另一部分放入-80℃冰箱中保存，供Western blot，Q-PCR检测。

1.5 心脏胶原蛋白染色

采用天狼星红染色法观察心脏组织胶原蛋白的沉积。取适量心肌组织置于4%多聚甲醛液中固定48 h，而后酒精梯度脱水、石蜡包埋，连续6 μm切片，制作心肌组织石蜡切片备用。天狼猩红色染色时，取备用的心肌石蜡白片，常规脱蜡、依次梯度水化，天狼星红染色液滴染1 h，流水稍冲洗，去除切片表面染液，常规脱水透明，中性树胶封固。染色结果，常规显微镜可观察心肌胶原纤维被染成红色,心肌组织被染成黄色，或者无色。 偏振光显微镜下可以区分I型和III型胶原。

1.6 Western blot 检测蛋白表达

将适量心肌组织剪碎，加入组织裂解液，低温超声破碎制成匀浆，4℃环境下以12 000 r/min转速离心15 min，取上清，用 BCA 法测定蛋白浓度，制成蛋白样品。取适量蛋白上样，SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭 90 min，TBST液，然后分别给予1∶500 稀释的兔抗大鼠 TGF-β抗体、兔抗大鼠Smad2/3 抗体、兔抗大鼠p-Smad2/3 抗体兔抗大鼠、兔抗大鼠 CollagenⅠ抗体、兔抗大鼠 Collagen Ⅲ 抗体、兔抗大鼠 Fibronection抗体、兔抗大鼠 Tublin 抗体，4℃孵育过夜; TBST冲洗，加入滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG (1∶5 000)孵育 90 min，TBST 洗涤，ECL 发光显色，灰度扫描后，用 Quantity One 分析软件对蛋白电泳条带进行分析，以目标蛋白条带灰度/内参Tublin条带灰度值表示蛋白相对表达量。

1.7 荧光实时定量 PCR 检测

取适量心肌组织，利用Trizol试剂提取该组织总RNA，用M-MLV逆转录酶(RR047A,TaKaRa，Dalian，China)通过将1 μg总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应溶液：含40 ng cDNA，目的基因特异性引物，和2×SYBR PreMix Ex Taq(RR820A, TaKaRa，Dalian，China)。以 GAPDH 作为内参。根据以下参数进行反应：预变性95℃×5 min，变性 94℃×30 s，退火 60℃×30 s，延伸72℃×30 s，共 40 个循环。用荧光定量PCR(Bio-Rad，CFX Connection，Hercules，USA)检测PCR扩增。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制剂-2 (tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP-2)的上游引物及下游引物见表1。采用2-ΔΔCt计算，以 GAPDH 为内参定量目的基因(MMP-2、TIMP-2)mRNA相对表达量。

1.8 统计学处理

Tab. 1 PCR primer sequences

2 结果

2.1 消痰化瘀利窍中药组方对CIH大鼠心肌间质胶原沉积的影响

常规显微镜下观察，天狼星红染色胶原组织为红色，心肌组织为黄色。Normoxia组和TCMC组大鼠心肌间质中的胶原纤维量少，排列整齐。与Normoxia组比较，CIH大鼠心肌间质中的胶原纤维含量明显增加，且分布杂乱；与CIH组比较，CIH + TCMC组大鼠心肌间质中的胶原纤维明显减少(图1)。同样偏振光显微镜下，与Normoxia组比较，CIH组大鼠心肌组织显示很强的双折光性,橙色的粗纤维明显增加，且分布杂乱；但TCMC组无明显变化。与CIH组比较，CIH + TCMC组大鼠显示很强的双折光性，橙色的粗纤维明显减少。

Fig. 1 Deposition of collagen fibers in myocardial tissues of each group(Sirius red staining ×200)

2.2 消痰化瘀利窍中药组方对CIH大鼠心肌组织 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和Fibronectin蛋白表达的影响

与Normoxia大鼠比较，CIH大鼠心肌组织中 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和Fibronectin蛋白表达水平明显升高(P均<0.01)，而TCMC组无明显变化(P均>0.05)。与CIH大鼠相比，CIH +TCMC组 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和Fibronectin蛋白表达水平明显降低(分别为P<0.05，P<0.01，P<0.05，图2，表2)。

2.3 消痰化瘀利窍中药组方对CIH诱导的大鼠心肌组织内TGF-β/Smads 信号通路的影响

与Normoxia大鼠比较，CIH大鼠心肌组织中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平明显增多(P均<0.01)，而TCMC组无明显变化(P均> 0.05)。与CIH大鼠相比，CIH +TCMC组TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平明显减少(分别为P<0.01，P<0.05，P<0.01)。提示消痰化瘀利窍中药组方提前干预后，TGF-β/Smads信号通路被抑制(图 3，表3)。

Fig. 2 Protein expression levels of collagenⅠ, collagen Ⅲ and fibronectin in each group of myocardial tissue using Western blot

Tab. 2 Protein expressions of collagenⅠand collagen Ⅲ and fibronectin in myocardial tissues of each group ( protein expression /tublin) n=10)

Fig. 3 Expressions of TGF-, p-smad2 and p-smad3 in myocardial tissue by Western blot

Tab. 3 The protein expressions of TGF-, p-smad2 and p-smad3 in myocardial n=10)

Tab. 3 The protein expressions of TGF-, p-smad2 and p-smad3 in myocardial n=10)

**P<0.01 vs normoxia； # P<0.05,##P<0.01 vs CIH

2.4 消痰化瘀利窍中药组方对CIH大鼠心肌组织 TIMP-2mRNA表达的影响

相对于Normoxia大鼠，CIH大鼠心肌组织中， TIMP-2mRNA表达水平明显增多，MMP-2mRNA表达水平明显减少(P均<0.01); 而TCMC组无明显变化(P均>0.05)。与CIH组比较，CIH+TCMC组大鼠心肌组织 TIMP-2mRNA表达水平明显减少，MMP-2mRNA水平明显增多 (P均<0.05，表4)。

Tab. 4 mRNA expressions of TIMP-2 and MMP-2 in myocardial tissues of each group by n=10)

3 讨论

正常状态下，分布于心肌间质中的成纤维细胞既可以合成、分泌胶原蛋白，还可合成基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶抑制剂，以维持细胞外基质的动态平衡[10]。当心肌组织受到缺氧、缺血及炎症等因素刺激后，间质纤维细胞增生、细胞外基质过量沉积[11]、各型胶原比例失调，导致心肌顺应性降低，心脏舒缩功能障碍[12]，最终导致慢性心力衰竭[13]。因此延缓或抑制心肌纤维化是防治心功能下降的前提基础。在长期间歇性低氧环境下的反复低氧、复氧引起的氧化应激、炎症反应的刺激作用下，心脏成纤维细胞被激活并不断增殖活化为肌成纤维细胞，持续激活的肌成纤维细胞生成大量的CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和纤维连接蛋白，形成细胞外基质过度沉积，导致间质纤维化[4,14]。本研究发现，CIH大鼠心肌组织大量胶原沉积，CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和Fibronectin蛋白表达水平增加明显，经中药消痰化瘀利窍组方干预后，CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和Fibronectin蛋白的表达水平显著下调，心肌纤维化程度明显降低，提示中药消痰化瘀利窍组方可能通过抑制肌成纤维细胞增殖，减少胶原蛋白沉积，从而抑制心肌纤维化。

MMPs是降解细胞外基质的重要介质，它们的活性与TIMPs的表达密切相关，TIMPs的表达能够调控MMPs的活性。研究表明，维持ECM正常代谢的关键是MMPs和TIMPs之间的分泌平衡，它们之间的失衡是诱发多种类型组织纤维化的重要因素[15]，若TIMPs高表达或MMPs低表达导致MMPs和TIMPs的动态失衡，可进一步导致胶原降解受抑而使胶原过度沉积致纤维化[16]，TGF-β1可上调TIMPs水平从而抑制MMPs活性，减少ECM的降解[17]。本研究发现，CIH大鼠心肌组织TGF-β蛋白和TIMP-2 mRNA表达水平均明显升高，MMP-2 mRNA表达水平明显下降，表明CIH激活TGF-β上调TIMP-2 mRNA表达导致MMP-2 mRNA降低，减缓ECM降解引起心肌间质纤维化。中药消痰化瘀利窍组方干预能明显下调CIH大鼠心肌组织中TGF-β蛋白及TIMP-2 mRNA表达水平，致使MMP-2 mRNA表达水平明显增高，促进ECM的降解，缓解心肌纤维化。

TGF-β诱导信号通路在器官纤维化中发挥着重要作用，Smads是 TGF-β的下游效应器, TGF-β可以通过诱导Smad2、Smad3蛋白的磷酸化调节心肌成纤维细胞的增殖、分化及细胞外基质的合成[18,19]。若TGF-β过表达，通过上述通路，上调collagenⅠ、collagenⅢ蛋白的表达、Fibronectin蛋白合成增多，介导心肌纤维化。以往的研究表明，通过抑制TGF-β/Smad信号通路来抑制心肌纤维化[20-22]。在本研究中，CIH大鼠心肌组织TGF-β、p-Smad2和p-Smad3 蛋白表达水平明显升高，表明CIH大鼠心肌组织中的TGF-β/ Smad信号通路被激活；经过中药消痰化瘀利窍组方干预后，TGF-β蛋白表达水平和磷酸化水平的Smad2/3显著降低，提示中药消痰化瘀利窍组方可能通过抑制 TGF-β/Smad信号通路活化，进而抑制肌成纤维细胞增殖，减少心肌组织胶原蛋白合成，达到抑制CIH大鼠的心肌纤维化。

综上所述，中药消痰化瘀利窍组方的干预可以下调CIH大鼠心肌组织中CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和Fibronectin蛋白的表达，干预CIH大鼠心肌纤维化的发生，这一作用与其调节 TGF-β/Smads 信号通路有关；此外还可通过下调 TGF-β表达，抑制TIMP-2mRNA表达，干预CIH大鼠心肌纤维化的发生。